蛋白质-氨基酸和肽

1、第三章第三章蛋白质化学蛋白质化学蛋白质化学摘要蛋白质化学摘要1. 蛋白质概论蛋白质概论4、蛋白质的一级结构、蛋白质的一级结构6蛋白质的蛋白质的性质性质2氨基酸氨基酸3、肽、肽5、蛋白质的、蛋白质的高级结构高级结构7蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化5、蛋白质的高级结构、蛋白质的高级结构一、蛋白质的三维结构一、蛋白质的三维结构 蛋白质的二级蛋白质的二级( (Secondary)Secondary)结构结构 是指肽链的主链在空间的排列是指肽链的主链在空间的排列, ,或多肽链主链中各个肽段形成的或多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。规则的或无规则的构象。二级结构肽链的主链在空间的走向-螺旋螺旋

2、-折叠折叠-转角转角无规卷曲无规卷曲肽链的二面角肽链的二面角 P205P205 二级结构的数学描述：二级结构的数学描述：环绕环绕CN键旋转的角度为键旋转的角度为环绕环绕CC2键旋转的角度称键旋转的角度称 多肽链的所有可能构象都能用多肽链的所有可能构象都能用和和这两这两个构象角来描述，称二面角。个构象角来描述，称二面角。 可以用（可以用（,）来描述肽链的二级结构来描述肽链的二级结构 1.1.螺旋螺旋 - -helixhelix p207p2071 1）典型的）典型的螺旋有如下特征螺旋有如下特征：用：用3.63.61313表示表示 是一种是一种右手右手螺旋螺旋 每圈螺旋：每圈螺旋：3.6个个a.a

3、残基，残基， 高度：高度：0.54nm 每个残基绕轴旋转每个残基绕轴旋转100，沿轴上升，沿轴上升0.15nm链内氢键维持螺旋稳定链内氢键维持螺旋稳定 相邻螺圈之间形成相邻螺圈之间形成链内链内氢键氢键，氢键的取向几乎与，氢键的取向几乎与中心轴平行。中心轴平行。 肽键上肽键上N-H氢与它后面（氢与它后面（N端）第四个残基上端）第四个残基上的的C=0氧间形成氧间形成氢键氢键 氨基酸残基氨基酸残基侧链侧链R R向外向外3.613 (ns)C(NHCCO)3 NOHHR2 2 ）R侧链对侧链对螺旋的影响螺旋的影响R侧链的侧链的大小大小和和带电性带电性决定了能否形成决定了能否形成螺旋以及形成的螺旋以及形

4、成的螺旋螺旋的稳定性。的稳定性。 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基残基, Gly在肽中连续存在时。在肽中连续存在时。 丝心蛋白丝心蛋白含含50%Gly，不形成不形成螺旋。螺旋。 R基大的基大的AA（如如Ile）连续存在时连续存在时，不易形成不易形成螺旋螺旋 Pro、羟脯氨酸羟脯氨酸中止中止螺旋。螺旋。 R基较小，且不带电荷的氨基酸基较小，且不带电荷的氨基酸连续存在连续存在利于利于螺旋螺旋的形成。的形成。 如多聚丙氨酸在如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成的水溶液中自发卷曲成螺旋。螺旋。 不不利利于于2. -折叠 - -折叠折叠是由两条或多条

5、几乎完全伸展的肽链平行排是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过列，通过链间的氢键链间的氢键交联而形成的片状结构。交联而形成的片状结构。 由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构片状结构； 主链骨架伸展呈主链骨架伸展呈锯齿状锯齿状； 借相邻借相邻主链主链之间的之间的氢键氢键维系。维系。 平行或反平行两种类型平行或反平行两种类型丝心蛋白丝心蛋白平行 -折叠反平行 -折叠3.3.- -转角（转角（-turn-turn） -转角也称转角也称-回折（回折（reverse turn）、）、-弯曲（弯曲（-bend）、）、发夹结构（发夹结构（hair-pi

6、n structure） 转角的特征：转角的特征： 由多肽链上由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。个连续的氨基酸残基组成。 主链骨架以主链骨架以180返回折叠。返回折叠。 第一个第一个a.a残基的残基的C=O与第四个与第四个a.a残基的残基的N-H生生成氢键成氢键 第第n个残基的羰基氧原子与个残基的羰基氧原子与n+3个残基上的亚氨基个残基上的亚氨基这类结构主要存在于球状蛋白分子中。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。4.4.无规卷曲无规卷曲 没有规律的多肽链主链骨架构象。没有规律的多肽链主链骨架构象。 无固定的走向，但也不是任意变动的无固定的走向，但也不是任意变动的 球状蛋白中含量较高，对外界理

7、化因子球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。敏感，与生物活性有关。 酶的活性部位 从从结构的稳定性结构的稳定性上看上看-右手螺旋右手螺旋-折叠折叠 U型回折型回折无规卷曲无规卷曲， 从从功能功能上看正好相反，酶与蛋白质的活上看正好相反，酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当，性中心通常由无规卷曲充当，-右手螺右手螺旋和旋和-折叠一般只起支持作用。折叠一般只起支持作用。 二）、超二级结构和结构域二）、超二级结构和结构域 p221 1.超二级结构超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的相互作用，

8、形成有规则的，在空间上能辨认的二级结二级结构组合体。构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。过渡态构象层次。已知有已知有3种种基本形式基本形式：、 2.结构域结构域 p223结构域：结构域：较大的蛋白质分子或亚基中，多肽链在二级结构较大的蛋白质分子或亚基中，多肽链在二级结构或超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的的在空间或超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的的在空间上可以明显区分的近似球状区域。上可以明显区分的近似球状区域。 具具有部分生物功能。有部分生物功能。 铰链区铰链区对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结对于较

9、大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构构域缔合而成三级结构。三）、三）、 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构1.定义整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。肌红蛋白三级结构 亲水基位于球体表面亲水基位于球体表面,疏水基位于球体内部疏水基位于球体内部 球状蛋白溶于水球状蛋白溶于水共价键共价键次级键次级键化学键化学键 肽键肽键一级结构一级结构氢键氢键二硫键二硫键二、三、四级结构二、三、四级结构疏水作用疏水作用盐键盐键范德华力范德华力三、四级结构

10、三、四级结构2.蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质分子中的共价键与次级键二硫键二硫键共价键共价键盐键(离子键）氢键二硫键疏水键氢键氢键疏水键蛋白质的空间作用力四）、四）、 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构1.定义定义多条肽链通过非共价键（氢键、疏水键、离子键、多条肽链通过非共价键（氢键、疏水键、离子键、范德华力）形成的聚合体的结构就是四级结构范德华力）形成的聚合体的结构就是四级结构 。每条肽链都有自己的三级结构，称为每条肽链都有自己的三级结构，称为亚基亚基或亚单位或亚单位 维持四级结构的作用有：氢键、疏水作用、静电作用、维持四级结构的作用有：氢键、疏水作用、静电作用、共价健共价健 血红蛋白四级

11、结构 均一寡聚蛋白均一寡聚蛋白由相同亚基构成由相同亚基构成 非均一寡聚蛋白非均一寡聚蛋白由不同亚基构成由不同亚基构成2.2.蛋白聚集成四级结构具有下列优势蛋白聚集成四级结构具有下列优势 增强结构稳定性；增强结构稳定性；提高遗传经济性和效率；提高遗传经济性和效率；使催化基团汇集在一起，提高催化效使催化基团汇集在一起，提高催化效率。率。 寡聚酶寡聚酶具有协同性和别构效应。具有协同性和别构效应。蛋白质的结构层次 1、一级结构 2、二级结构 3、三级结构 4、四级结构 一级结构一级结构：蛋白质分子中氨基酸残基的排：蛋白质分子中氨基酸残基的排 列顺序和连接方式列顺序和连接方式二级结构二级结构：多肽链主链

12、中各个肽段形成的规则的或无规则的：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的 构象。构象。主要有主要有-螺旋、螺旋、折叠、折叠、-转角、无规卷曲转角、无规卷曲。超二级结构：超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有 规则的二级结构的组合体如规则的二级结构的组合体如、。结构域结构域：在二级或超二级结构的基础上通过多次折叠，在空：在二级或超二级结构的基础上通过多次折叠，在空 间上形成一些半独立的紧密球状结构，叫结构域，间上形成一些半独立的紧密球状结构，叫结构域， 它是三级结构的一部分，结构域之间靠无规卷曲连接。它是三级结构的一部分，结构域之间靠无规卷曲

13、连接。 一般由一般由100-200个氨基酸残基构成。个氨基酸残基构成。三级结构三级结构：在二级结构基础上，多肽链通过盘旋、折叠，形：在二级结构基础上，多肽链通过盘旋、折叠，形 成紧密的球状构象。成紧密的球状构象。亚基或亚单位亚基或亚单位 四级结构四级结构：亚基通过非共价键形成的聚合体的结构：亚基通过非共价键形成的聚合体的结构 蛋白质一级结构蛋白质一级结构(序列序列)中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。 蛋白质的等电点（蛋白质的等电点（pI）蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带蛋白质在其

14、等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点负电荷，在等电点pH时为两性离子。时为两性离子。在等电点条件下，蛋白质的溶解度最小，粘度最大。在等电点条件下，蛋白质的溶解度最小，粘度最大。 蛋白质的等电点不是一成不变的，它随溶剂性质、离子强度等因素而蛋白质的等电点不是一成不变的，它随溶剂性质、离子强度等因素而改变。改变。等离子点：等离子点：在没有其他盐类干扰时，即在没有其他盐类干扰时，即纯水中蛋白质的正离子数等于负纯水中蛋白质的正离子数等于负离子的离子的pH值。值。 是每种蛋白质的特征常数。是每种蛋白质的特征常数。 （一）蛋白质的两性电离及等电点（一）蛋白质的两性电离及等电点 p290

15、6 蛋白质的性质蛋白质的性质（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 p299大小在大小在1100nm布郎运动、丁达尔效应、不能透过半透膜（半通透性）蛋白质溶液稳定的原因蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水化膜；）表面形成水化膜； 2）表面电荷（带相同电荷）。）表面电荷（带相同电荷）。+（三）蛋白质的沉淀反应（三）蛋白质的沉淀反应 p300盐析法：盐析法：加入大量的中性盐，脱去水化层而沉淀加入大量的中性盐，脱去水化层而沉淀 盐溶与盐析盐溶与盐析分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（血清球蛋

16、白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀重金属盐沉淀法：重金属盐沉淀法：当当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀生物碱试剂或酸类沉淀法生物碱试剂或酸类沉淀法：当当pH小于等电点时，蛋白质小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶颗粒带净正电荷，易与

17、生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀性盐而沉淀加热变性沉淀法：加热变性沉淀法：蛋白质因加热变性而凝固蛋白质因加热变性而凝固（四）蛋白质的变性（四）蛋白质的变性 p233天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但由氢键、盐键等次级键维系的高度规律性的空间排列发生由氢键、盐键等次级键维系的高度规律性的空间排列发生变化，致使其生物学活性、理化性质发生改变，称为变化，致使其生物学活性、理化性质发生改变，称为蛋白蛋白质的变性。质的变性。有些蛋白质的变性作用是有些蛋白质的变性作用是可逆的可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理，其变性如不超过一

18、定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质后，可重新变为天然蛋白质。变性的实质：变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，高级结构破坏，天然构象解体。次级键（有时包括二硫键）被破坏，高级结构破坏，天然构象解体。 变性不汲及一级变性不汲及一级 结构的破坏。结构的破坏。 变性的因素： 化学因素：化学因素： 强酸和强碱强酸和强碱破坏了盐链；破坏了盐链； 有机溶剂有机溶剂破坏水化膜；破坏水化膜； 去污剂去污剂:SDS:SDS 还原性试剂：尿素、还原性试剂：尿素、 -硫基乙醇；硫基乙醇； 盐浓度盐浓度 等等 物理因素物理因素：温度；机械力；光（温度；机械力；光（X-X-光，紫外照射），光，紫外照射），

19、超声波等超声波等变性蛋白质的特性：变性蛋白质的特性：生物活性丧失生物活性丧失,不能结晶是蛋白质变性的主要特征。不能结晶是蛋白质变性的主要特征。溶解度降低易沉淀。溶解度降低易沉淀。 粘度、颜色反应增加粘度、颜色反应增加分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。实际应用：实际应用： A.消毒灭菌：消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温。乙醇，紫外线，高温。 B.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。 （五）紫外吸收性质（五）紫外吸收性质 最大吸收峰的波长是最大吸收峰的波长是280nm 核酸是核酸是260nm反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团

20、反应有关基团有此反应的有此反应的蛋白质或氨蛋白质或氨基酸基酸双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO2紫 色 或 粉紫 色 或 粉红色红色二个以上肽键二个以上肽键所有蛋白质所有蛋白质米伦反应米伦反应H g N O3、H g ( N O3)2及及HNO3混合物混合物红色红色 Tyr黄色反应黄色反应浓浓HNO3及及NH3黄 色 、 橘黄 色 、 橘色色 Tyr、Phe乙醛酸反应乙醛酸反应(Hopking-Cole反反应应)乙 醛 酸 试 剂 及乙 醛 酸 试 剂 及浓浓H2SO4紫色紫色 Trp坂口反应坂口反应(Sakaguchi反应反应)-萘酚、萘酚、NaClO红色红色胍基胍基Arg酚试剂反应酚试

21、剂反应(Folin-Cioculteu反应反应)碱性碱性CuSO4及磷及磷钨酸钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基Tyr 、Trp茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基自由氨基及羧基-氨基酸氨基酸 （六）蛋白质的颜色反应（六）蛋白质的颜色反应OHN7 蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化 p301p301实质：蛋白与非蛋白分开，蛋白质之间分开实质：蛋白与非蛋白分开，蛋白质之间分开分离纯化蛋白质的程序为：分离纯化蛋白质的程序为：1）前处理（细胞或组织处理）前处理（细胞或组织处理）2）粗分级分离（除去杂蛋白）粗分级分离（除去杂蛋白）3）细分级分离）细分级分离。4）结晶）结晶一）根

22、据分子大小不同分离方法一）根据分子大小不同分离方法p3021.透析和超过滤透析和超过滤 透析透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离； 超过滤超过滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜 上而分离。上而分离。2.密度梯度离心：密度梯度离心： 蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自

23、身密度与其自身密度相等的介质密度梯度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。离成不同的区带。见见P302页。页。 常用离心介质：蔗糖和氯化铯常用离心介质：蔗糖和氯化铯3.凝胶过滤凝胶过滤 即分子排阻层析（分子筛层析）。即分子排阻层析（分子筛层析）。 凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。当大小不同的分子流经凝胶层析柱是，比凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。当大小不同的分子流经凝胶层析柱是，比凝胶孔隙大的分子不能进入珠孔内，从颗粒间隙穿过，行程短，被先洗脱下来；凝胶孔隙大的分子不能进入珠孔内，从颗粒间隙穿过，行程短，被先洗脱下

24、来；较小的分子可以进入凝胶颗粒内部，路径迂回曲折，行程长，后洗脱下来。较小的分子可以进入凝胶颗粒内部，路径迂回曲折，行程长，后洗脱下来。这样根据不同大小分子所经的路径不同而得到分离，大分子最先流出层析柱，小分子这样根据不同大小分子所经的路径不同而得到分离，大分子最先流出层析柱，小分子后流出。后流出。凝胶过滤示意图凝胶过滤示意图二）根据溶解度差别分离的方法二）根据溶解度差别分离的方法1.等电点沉淀和等电点沉淀和pH控制控制 等电点时蛋白质溶解度最低，易沉淀。各个蛋白质的等电点时蛋白质溶解度最低，易沉淀。各个蛋白质的pI不同，不同，通过控制通过控制pH使达到某一蛋白的使达到某一蛋白的pI而沉淀。而

25、沉淀。2.盐溶和盐析：盐溶和盐析： 中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。 原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，而与水分子相互作用加强；原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，而与水分子相互作用加强；中性盐在中性盐在高浓度的高浓度的时可降低蛋白质的溶解度，即盐析时可降低蛋白质的溶解度，即盐析。 当离子强度增大到足够高时，此时将夺取与蛋白质的水化层，且当离子强度增大到足够高时，此时将夺取与蛋白质的水化层，且盐中和了蛋白表面的电荷，使蛋白质凝聚沉淀盐中和了蛋白表面的电荷，使蛋白质凝聚沉淀分段盐析分段盐析硫酸铵硫酸铵有机溶剂分级分离法三）根据电荷不同分离方法三

26、）根据电荷不同分离方法1.电泳电泳2.离子交换法离子交换法1.电泳电泳：电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。带电颗粒在电场中移动的现象。 同一同一p H 下，分子大小不同的蛋白质所带净下，分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。分开。1）. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2）. 区带电泳区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2）凝胶电泳

27、：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。a）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。+ b）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。-+3）.等电聚焦电泳等电聚焦电泳：外加电场时，蛋白质混合物在具有外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移动，当蛋白质在其等电点时，净电梯度的介质中移动，当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。荷为零，在电场中不再移动。+5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电+2.离子交换层析离子交换层析 利用不同的蛋白利用不同的蛋白质质分子在溶液中所帶分子在溶液中所帶电电荷荷不同，因而不同，因而与与离离子子交交换树换树脂脂有不同之吸附

28、力而有不同之吸附力而分分离之离之改变溶液的改变溶液的pH值值和和盐离子盐离子浓度，结合力最小的浓度，结合力最小的蛋白质先洗脱下来。蛋白质先洗脱下来。例如例如弱酸型的弱酸型的CM-纤维素纤维素-阳离子交换剂阳离子交换剂弱碱型的弱碱型的DEAE-纤维素纤维素-阴离子交换剂阴离子交换剂 纤维素也可换成交联葡聚糖纤维素也可换成交联葡聚糖四）根据对配体的特异生物学亲和力分离四）根据对配体的特异生物学亲和力分离亲和层析亲和层析 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。离的一种方法，称之为亲和层析。 用游离的相应配体溶液洗脱用游离的相应配体溶液洗脱配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子八八 蛋白质的含量、纯度鉴定蛋白质