利用连续传代法去除质粒

1、利用连续传代法去除质粒实验目的：利用连续传代法使质粒丢失，以便进行下一步的基因敲除实验。具体实验方案如下：1、 首先需鉴定我公司的菌种是否为营养缺陷型菌株。 取Lysine单菌落，在基本琼脂培养基上划线，37培养，每天观察菌体生长情况，如果该菌能在基本培养基上生长，则确定该菌为非营养缺陷型，如果不能在基本培养基上生长，则可以确定该菌为营养缺陷型菌株。 如果鉴定Lysine菌为营养缺陷型，那么需要确定它是哪种氨基酸缺陷型，鉴定的具体方案如下：（1）挑取Lysine单菌落接种于5ml LB（含有25 g/mL卡那霉素）液体培养基中，37、200rpm振荡培养30h。（2）取1.5mL培养液于离心管

2、中，12000rpm离心5min，弃去上清液，菌体用生理盐水洗涤2次，打匀管底菌团，每次12000rpm离心5min，最终悬浮于1.5mL生理盐水中，取1ml菌悬液涂布于基本琼脂培养基上，在培养皿的中央分别放置蘸有5g/L苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸+蛋氨酸和以上五种氨基酸混合液的滤纸片，37温箱中培养，定期观察，若某种氨基酸周围有生长圈，即表明为该类营养物质的营养缺陷型菌株。如果鉴定出Lysine菌为某种氨基酸营养缺陷型，那么在后续用的基础培养基中均需加入该氨基酸以确保菌体能够生长。2、 连续传代首先，以时间为横坐标，菌液OD值为纵坐标做一条菌体生长曲线，具体步骤如下：（

3、1） 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基（2） 按一定量分装到试管里（需要13*3支，3支一组），灭菌。 （3） 冷却后取Lysine菌悬液，用移液枪分别接种到试管培养基中 (接种比列同大发酵罐)（4） 把12组放入37度摇床培养，另一组马上测OD600值，三个值取平均数，偏差太大者舍去 （5） 在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时后分别测定其他组的OD值。（6） 将得到的值做图，确定对数生长中期所对应的时间。然后挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基，在37以200 r/min振荡培养使Lysine菌达到对数生长中期，取50 L菌液转接到5 mL无抗性的基本液体培养基

4、中，37 震荡培养。连续培养30-50代，转接方法同上，所用的培养基也是无抗性的基本液体培养基。3、 检测在连续传代的同时，每传5代检测质粒消除情况，检测方法如下：取100ul菌液稀释1000000倍后，再取稀释液100ul在无抗性的固体基本培养基上涂布，37培养。待菌体长出后，挑取单克隆在无抗性的基本培养基上划线，37培养。待菌体长出后，挑取单克隆于含有25 g/mL卡那霉素的固体基础培养基上划线，如果能够生长，说明该质粒还没有消除或部分消除，如果没有生长，那么可初步鉴定质粒已消除，需要提取质粒进行进一步限制性内切酶酶切鉴定。（每次检测所用到的有抗性和无抗性的平板均需要保留）注：1、LB培养

5、基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，用5mol/LNaOH调节pH至7.0，用去离子水最后定容至1L，120灭菌20min。2、M9基本培养基：配制1L培养基，应在750ml无菌去离子水中加入：5-M9盐溶液 200ml1mol/L MgSO4 2ml20%葡萄糖 20ml1mol/L CaCl 0.1ml灭菌的去离子水至980ml。如果需要，可在M9培养基补加适当的氨基酸。5-M9盐溶液的配制：用去离子水溶解下列盐类，终体积为1L： 七水磷酸氢二钠 64g 磷酸二氢钾 15g 氯化钠 2.5g 氯化铵 5.0g注：葡萄糖溶液在加入到

6、M9盐溶液之前，用0.22微米滤器过滤除菌。3、 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：用去离子水溶解下列物质，终体积为1L：牛肉膏 3g 蛋白胨 10gNaCl 5g pH 7476 利用逐级增温传代法提高发酵温度实验目的:将lysine生产菌在不同温度（38，39，40）摇床上连续培养5-10代，使其能在不同温度下稳定生长，然后取不同温度的菌液进行发酵预实验，比较不同温度下赖氨酸的产量,希望该菌能在温度提高的条件下产酸量不变或有所提高，从而降低生产成本。实验方案如下：一：得到不同温度下稳定生长的lysine菌1. 配置LB液体培养基，按50ml的分装量加入到1L的三角瓶中，三瓶一组，121灭菌20

7、min。2. 取500ul Lysine菌悬液，接种到灭好的50ml LB培养基中，三瓶一组，然后38、200rpm振荡培养。3. 当培养液OD600达到0.6时，取500ul菌悬液接种到另一灭好的含50ulLB培养基的三角瓶中，共三瓶，38、200rpm振荡培养，当培养液OD600值达到0.6时，再转接到另一三角瓶中，方法同上，共传5-10代。4. 当传到菌在38时稳定生长后，将菌保存，并进行小罐发酵预实验，同时取500ul 38生长的Lysine菌悬液，接种到灭好的50ml LB培养基中，三瓶一组，然后39、200rpm振荡培养。5. 当培养液OD600达到0.6时，取500ul菌悬液接种

8、到另一灭好的含50ulLB培养基的三角瓶中，共三瓶，39、200rpm振荡培养，当培养液OD值达到0.6时，再转接到另一三角瓶中，方法同上，共传5-10代。6. 当传到菌稳定生长后，将39生长的菌保存，并进行小罐发酵预实验，同时取500ul 39生长的Lysine菌悬液，接种到灭好的50ml LB培养基中，三瓶一组，然后40、200rpm振荡培养。7. 当培养液OD600达到0.6时，取500ul菌悬液接种到另一灭好的含50ulLB培养基的三角瓶中，共三瓶，40、200rpm振荡培养，当培养液OD值达到0.6时，再转接到另一三角瓶中，方法同上，共传5-10代。8. 当传到菌稳定生长后，将40生

9、长的菌保存，并进行小罐发酵预实验。二：10L三联发酵罐培养（培养基、接种量及发酵条件等参数均与大发酵罐相同）（1）配制18L培养基，每罐分装6L，灭菌。（2）取在38下稳定生长的菌悬液按一定比列接种到发酵罐中，38发酵，每隔两个小时测定发酵液OD600值、糖含量、酸含量，并记录发酵过程中pH及容氧等的变化。（3）测定放罐酸含量，取平均值，与37时的产酸量进行对比（需要先在小发酵罐上37发酵确定最终产酸量），看产酸量是否有所变化,若没有明显减少可以进行下一步实验。（4）取在39下稳定生长的菌悬液按一定比列接种到发酵罐中，39发酵，每隔两个小时测定发酵液OD600值、糖含量、酸含量，并记录发酵过程中pH及容氧等的变化。（5）测定放罐酸含量，取平均值，与37以及38时的产酸量进行对比，看产酸量是否有所变化，若没有明显减少可以进行下一步实验。（6）取在40下稳定生长的菌悬液按一定比列接种到发酵罐中，40发酵，每隔