抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法79498

1、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四陛光化还原法）1、试剂的配制（1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液（PBS, pH7.8）:A 母液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO4 12H20 （分子量 358.14） 71.7g;B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2P04 2H2O （分子量 156.01） 31.2g。分别用蒸储水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS （pH7.8）的配制：分别取 A 母液（Na2HPO4） 228.75ml , B 母液（NaH2P。4） 21.25ml,用蒸储

2、水定容至 1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000: 267268。（2） 14.5mM甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。（3） 30dM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na 2用磷酸缓冲液定容至 100ml。（4） 60dM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。（5） 2.25mM 氮蓝四陛（NBT）溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。酶液制备：取0.2g （可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研

3、钵中， 加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在 4C、 12000g下离心20min ,上清液即为酶液。2、酶活性测定（1）反应混合液配制（以60个样为准）：分别取Met溶?夜162ml, EDTA-Na2溶液0.6ml, 磷酸缓冲液5.4ml, NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30 M酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min;同时做两支对照管，其中 1支试管取3ml反应混合液加入 30 M PBS （不加酶液）照光 后测定作为最大光还原管，另1支只加缓

4、冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560（出现颜色即 可测定）。（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制 NBT光化还原50%所需酶量（测的样品值要 在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD 总活性=（Ack-AE ） V （1/2Ack>W< Vt）SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）;比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；A e为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml ,加入PBS的体积）；Vt为测定时的酶液

5、用量（ml, 30ul）; W为样品鲜重（g,测定时应换算为叶绿体 的质量mg）;蛋白质含量单位为 mg/go二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）:分别取 A 母液（Na2HPO4 ） 123ml 和 B 母液（NaH 2PO4 ） 877ml 混匀即为 1000ml PBS（0.2M , pH6.0）;（2）反应混合液配制（以60个样为准）：取200ml PBS（0.2M , pH6.0）,加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热 搅拌溶解，冷却后加入 0

6、.112ml 30%的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：取3ml反应液并加入30 口酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。 （边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每 min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD= （ A A470 XVt / （W< Vs XQ.01 6 （u/g min）A A470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g） ; t为反应时间（min）; Vt为提取酶液总体积（ml, （1.6ml）; Vs为测定时取用酶液体

7、积（ ml, 30ul）。2、过氧化氢酶（CAT ）活性测定（1）试剂配制:0.15mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）:取 A 母?夜（Na2HPO4）457.5 ml 和 B 母液（NaH2P04）292.5 ml混合后用蒸储水定容至 1000ml。（2）反应液配制：取 200ml PBS （0.15M, pH7.0）,加入 0.3092ml 30% 的 H2O2 （原液） 摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml （可视情况调整）酶液，以 PBS为对照调零， 测定OD240 （紫外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每 min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。C

8、AT= A A240 x Vt /WW< Vs XQ.01 的 （u/g min）A A240为反应时间内吸光度的变化； W为样品鲜重（g） ; t为反应时间（min）; Vt为提 取酶液总体积（ml, 1.6ml）; Vs为测定时取用酶液体积（ ml, 0.1ml）。四、超氧阴离子自由基（。2.一）产生速率的测定（羟胺氧化法）1、试剂的配制（1） 1mM盐酸羟胺溶?称取 0.02085g盐酸羟胺用蒸储水定容至300ml;（2） 17mM对氨基苯磺酸溶液：称取 1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰 醋酸：水=1: 3配制）加热溶解后定容至 400ml;（3） 7mM -泰胺溶

9、液：称取 0.4008g “-泰胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水 =3: 1配制） 定容至400ml。2、O2.-含量的测定（1）样品液提取方法同 SOD测定；（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5ml PBS （0.05M, pH7.8）,1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。（3）在25 c下保温1小时；（4）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM a -泰胺，混合后快速摇匀；（5）在25c下保温20min后在3000Xg下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；（6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定 OD530值（测定）；（7）。

10、2.-含量的计算：由测得的 OD530,查NO2-标准曲线得到NO 2-；根据羟胺与O2.- 的反应式：NH2OH+2O2.-+H+NO2H2O2 +H2O 计算O2.,即NO2- >2=O2.;再。2.-产生速率（以 nmol min-1mg-1根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得蛋白表示，也可以nmol min-1g-1 鲜重表示）。O2.一产生速率=（CXV） / （t>W）（nmol min-1g-1 鲜重）C 为标准曲线上查得的浓度（umol/L） ； V 为测定时所取提取液用量（叶绿体稀释后的体积 ）； t 为反应时间（60min）； W 为样品鲜重（叶绿

11、体实际质量g）参考文献：王爱国，罗广华.植物生理学通讯，1990, （6）: 5557五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA 100g 三氯乙酸 f1L0.67%TBA 3.35g 硫代巴比妥酸 -500ml 10%TCA （避光）2、测定步骤:0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨-12000g 离心 10min -上清 1.5ml +1.5 0.67% TBAf沸水煮 30min -冷却，离心上清 OD5。，OD32, OD003、计算组织中MD总量：MDAB度 C （umol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450MD给量（umol/g FW）=C X

12、 V/W式中V为提取液体积（1.6ml） , W为样品鲜重（0.2g）。六、 植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（ 1 ）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g ，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；（ 2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml 大离心管）中，加10ml 去离子水，在室温下放置3h 使叶片充分吸水后测定溶液电导率（R1） ；（ 3）再放入恒温水浴锅中在100沸水浴中煮20min 以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率（R2） ；（ 4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（% =R1/R2X100%还可以计算植株伤害程

13、度：伤害率二（处理电导率一对照电导率）/ （煮沸电导率一对照电导率）X 100%七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（ 1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg 考马斯亮蓝，溶于50 ml 90乙醇中，加入100 ml 85% （W/V）的磷酸，再用蒸储水定容到1L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温卜可在暗中保存一个月。（2） 100g/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml, 再从中吸取 40ml用蒸储水定容至 100 ml （也可取10mg BSA定容至100ml即为100 d g/ml 标准 BSA 溶液） 。2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20"提取液（酶液）加入 80屋0.05M, pH