实验一、蛋白质含量测定2012ppt课件

1、生物化学与分子生物学基础实验 实验一实验一 几种蛋白质定量测几种蛋白质定量测定方法的比较定方法的比较生物化学与分子生物学基础实验1 1 掌握紫外吸收法、掌握紫外吸收法、FolinFolin酚试剂法酚试剂法LowryLowry法和考马斯亮蓝染色法法和考马斯亮蓝染色法BradfordBradford法测定蛋白质含量的原法测定蛋白质含量的原理和方法理和方法2 2 掌握分光光度计的原理和使用方法掌握分光光度计的原理和使用方法实验目的实验目的生物化学与分子生物学基础实验有多少样品可供分析有多少样品可供分析; ; 蛋白质样品浓度大约是多少蛋白质样品浓度大约是多少; ; 样品中含有哪些可能影响定量的化学物质

2、；样品中含有哪些可能影响定量的化学物质；所选方法是否简单、可靠；所选方法是否简单、可靠；含量测定的专一性要求是否很高。含量测定的专一性要求是否很高。选择合适的蛋白质含量测定方法主要选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑：基于几点考虑：生物化学与分子生物学基础实验常用的方法常用的方法n物理性质：紫外吸收法物理性质：紫外吸收法n化学性质：化学性质：Folin酚试剂法酚试剂法Lowry法），法），BCA法法Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法法），凯氏定氮法，双缩脲法Biuret法），胶体金测定法，等等法），胶体金测定法，等等n染色性质：考马斯亮蓝染色法染色性质：考

3、马斯亮蓝染色法Bradford法）、银染法）、银染法法n 测定绝对含量应用凯氏定氮法蛋白质的含氮量测定绝对含量应用凯氏定氮法蛋白质的含氮量为为16）。）。生物化学与分子生物学基础实验 蛋白质在紫外光区蛋白质在紫外光区190nm-360nm有两个有两个强烈吸收峰：强烈吸收峰：280nm和和190nm。 280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和、和酪氨酸酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收有芳香环，可吸收280nm波长的光子，波长的光子，苯丙氨酸苯丙氨酸Phe）、组氨酸）、组氨酸

4、His也有微弱吸收。也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质，其因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收的吸收值差别很大值差别很大(图图1)。 紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验图图1.1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱蛋白质和核酸的紫外吸收光谱图图A A是是15g /ml15g /ml蛋白的吸收光谱。图蛋白的吸收光谱。图A A中插图是中插图是1mg/ml1mg/ml的牛免疫球蛋白的牛免疫球蛋白IgG(I)IgG(I)、牛血清白蛋白、牛血清白蛋白(B)(B)和白明胶和白明胶(G)(G)的

5、吸收光谱，缓冲液为：的吸收光谱，缓冲液为：0.01% 0.01% Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图图B B是是10g /ml RNA10g /ml RNA和和DNADNA的吸的吸收光谱。收光谱。生物化学与分子生物学基础实验肽键在肽键在190nm有强吸收峰。有强吸收峰。一般分光光度计在一般分光光度计在190nm的光强较弱，且的光强较弱，且O2在此波长有吸收，因此通常使用在此波长有吸收，因此通常使用205nm或或210nm波长，波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, an

6、d Arg的侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较的侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。稳定。缺陷缺陷: 干扰因素多。许多化学物质特别是含干扰因素多。许多化学物质特别是含CC双键和双键和CO双键的物质在此波长范围有双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。吸收，所以必须严格控制反应条件。 紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验优点：优点：不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏；坏；测量极其简单迅速；测量极其简单迅速；蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质

7、。适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。 紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验缺陷：缺陷：干扰测定的影响因素多，尤其是干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和和DNA在此波长均有强吸收在此波长均有强吸收, 所以一定要所以一定要考虑样品中是否有核酸考虑样品中是否有核酸.要得到准确可要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的靠的结果，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。品的实验条件一致。敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那用标准曲线法测定蛋白质

8、含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。差异大的蛋白质，误差较大。 紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验管号管号0 01 12 23 34 45 56 67 7标准蛋白溶标准蛋白溶液液mlml）0 01.01.01.51.52.02.02.52.53.03.04.04.00 0双蒸水双蒸水mlml）4.04.03.03.02.52.52.02.01.51.51.01.00 00 0蛋白质含量蛋白质含量(mg/ml)(mg/ml)0 00.250.250.3750.3750.50.50.620.625 50.70.75

9、51.01.0未知蛋白溶未知蛋白溶液液mlml）-4.04.0A280A280操作步骤操作步骤紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法Bradford法）法）原理：该方法由原理：该方法由BradfordBradford于于19761976年建立。在酸性条件下，年建立。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由大光吸收波长由465nm465nm红色红色转移为转移为595nm595nm蓝色），起作用蓝色），起作用的主要氨基酸是的主要氨基酸是ArgArg，另外，另外，His, Lys, Tyr, TrpHis, Lys,

10、Tyr, Trp和和PhePhe也也有作用。有作用。2 25min5min呈最大光吸收，至少可呈最大光吸收，至少可稳定稳定1 1小时小时生物化学与分子生物学基础实验n简便简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂试剂n影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有干扰干扰n小于小于3000Da 的多肽无法测定的多肽无法测定n蛋白浓度高时非线性蛋白浓度高时非线性n配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝蓝G250考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法Bradford法）法）生物化学与分子生物学基础实验

11、实验操作步骤实验操作步骤 室温放置室温放置5 5分钟后测分钟后测595nm595nm的光吸。的光吸。考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇洗涤后，用双蒸水清洗。洗涤后，用双蒸水清洗。注意混匀，但不要剧烈震荡。注意混匀，但不要剧烈震荡。 管号01234567标准蛋白ul010204060801000蒸馏水ul100908060402000待测蛋白ul -100Bradford试剂5ml5ml5ml5ml5ml5ml5ml5mlA595考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法Bradford法）法）生物化学与分子生物学基础实验原理：原理：F

12、olin-Folin-酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙 组成。组成。试剂甲中的试剂甲中的Cu2+Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还碱性条件下与肽键形成络合物并被还原成原成Cu+Cu+。 Cu+Cu+以及蛋白质中的以及蛋白质中的TyrTyr等的侧链基团与试剂乙反应，等的侧链基团与试剂乙反应，试剂乙中的磷钼酸盐试剂乙中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的磷钨酸盐被蛋白质中的TyrTyr和和PhePhe残基还原，产生蓝色化合物钼兰和钨兰的混合残基还原，产生蓝色化合物钼兰和钨兰的混合物），显色反应在物），显色反应在3030分钟内接近极限。分钟内接近极限。颜色深浅与蛋

13、白含量成正比，可在颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm640nm下测光吸收。下测光吸收。 Folin-酚试剂法酚试剂法Lowry法）法）生物化学与分子生物学基础实验酸、铜离子螯合剂如酸、铜离子螯合剂如EDTA、柠檬酸等）、还原剂如巯基乙、柠檬酸等）、还原剂如巯基乙醇、醇、DTT、苯酚等干扰本反应。、苯酚等干扰本反应。不同蛋白质主要因其所含的不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。含量不同而呈现不同的吸收强度。进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在条件下稳定，但上述还原反应

14、只在pH=10的情况下发生，故当试的情况下发生，故当试剂乙加到碱性的铜剂乙加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钼酸磷钨酸试剂磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。这一步被破坏之前，还原反应即能发生。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。混合速度要快，否则会使显色程度减弱。因因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。制时间。费时较长，试剂配制较繁琐。费时较长，试剂配制较繁琐。Folin-酚试剂法酚试剂法Lowry法）法）生物化学与分子生物学基础实验实验步骤实验

15、步骤 01234567标准蛋白（标准蛋白（1mg/ml）ul02040801201602000待测样品待测样品 ul-200蒸馏水蒸馏水 ul1000980960920880840800800Folin-酚试剂甲酚试剂甲 ml44444444混匀，于室温放置混匀，于室温放置10分钟分钟Folin-酚试剂乙酚试剂乙 ul250250250250250250250250迅速混匀，迅速混匀，30水浴保温水浴保温30分钟分钟A640Folin-酚试剂法酚试剂法Lowry法）法）生物化学与分子生物学基础实验试剂、实验材料：试剂、实验材料：（已放在每个试验台的架（已放在每个试验台的架子上）子上） 标准蛋白

16、溶液：标准蛋白溶液：1mg/ml BSA 未知蛋白溶液未知蛋白溶液 考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝染色液 Folin-酚试剂甲酚试剂甲 Folin-酚试剂乙酚试剂乙生物化学与分子生物学基础实验Lowry 法的改进法。法的改进法。碱性条件下，蛋白分子中的肽键与碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并形成络合物，并将将Cu2+还原成还原成Cu+；Cu+与与BCA结合成紫色复合物，在结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓处吸收值与浓度呈正比度呈正比BCA法法生物化学与分子生物学基础实验n与与Lowry方法相比，方法相比，BCA法的操作更简单，法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质

17、的影响，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高微量检测可达到灵敏度更高微量检测可达到0.5g/ml），），应用更加灵活。应用更加灵活。n可耐受高达可耐受高达5%的表面活性剂的表面活性剂n测定不同蛋白样品时比测定不同蛋白样品时比bradford测定法结测定法结果均一果均一 BCA法法生物化学与分子生物学基础实验常用的测定蛋白质含量方法的比较方方 法法测定范围测定范围（g/ml）不同种类不同种类蛋白的差异蛋白的差异最大吸收最大吸收波长波长(nm)特特 点点凯氏定氮法凯氏定氮法小小标准方法，准确，操作麻烦，费时，标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定灵敏度低，适用于标准

18、的测定紫外吸收法紫外吸收法1001000大大280205灵敏度稍低，快速，不消耗样品，灵敏度稍低，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响核酸类物质有影响双缩脲法双缩脲法100010000小小540重复性、线性关系好，灵敏度低，重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大测定范围窄，样品需要量大Folin-酚试剂法酚试剂法20500大大500-750灵敏，费时较长，干扰物质多灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮蓝考马氏亮蓝G-25050500大大595灵敏度高，稳定，误差较大，颜色灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移会转移BCA202000大大562灵敏度高，稳定，干扰因素少，费灵敏度高，稳

19、定，干扰因素少，费时较长时较长生物化学与分子生物学基础实验1、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差异。法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差异。 2、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。化学构成类似的标准蛋白作标准品。 3、所

20、有的样品包括标准样品），都必须在规定时间、所有的样品包括标准样品），都必须在规定时间内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出的样品浓度与实际的浓度不符。的样品浓度与实际的浓度不符。 注注 意意生物化学与分子生物学基础实验722型光栅分光光度计型光栅分光光度计光光源源单单色色器器样样品品池池光光电电源源件件读读数数单单元元测量完毕，请把光度计的盖打开测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 讲解完毕后，每个组出一个同学去讲解完毕后，每个组出一个同学去127听老师讲解仪器使用。听老师讲解仪器使用。生物化学与分子生物学基础实验TU1800 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计波长范围：波长范围：2001100nm测光系统：单光束测光系统：单光束功能指标：光度测量功能指标：光度测量 光谱扫描光谱扫描 定量测量定量测量钨灯：钨灯：3401100nm氘灯：氘灯：200340nm生物化学与分子生物学基础实验1 测紫外吸收要用石英比色皿测紫外吸收要用石英比色皿 ！2 定量实验取液要准确。定量实验取液要准确。3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润洗。润洗。 因此因此3ml溶液足够测定。溶液足够测定。4 测量完毕，请把光度计的盖打开测量完毕，请