细胞工程复习重点

1、第1章 细胞培养1、细胞系：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。2、细胞株：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。3、传代：体外培养细胞生长增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液（培养基），这一过程叫传代。4、基本条件：无菌无毒、营养需要、生长环境（pH值、温度、渗透压）5、设备：环境（无菌实验室、净化工作台、恒温培养箱、CO2罐） 储存（液氮储存罐、液氮运输罐、超低温冰箱） 处理（倒置显微镜、离心机、高压蒸汽消毒器、干燥箱、高温烤箱）6、培养基

2、必须具备的基本条件： 营养物质、缓冲能力、等渗性、无菌7、 生长状态指标： 细胞生长曲线&生长倍数、细胞分裂指数、细胞接种存活率、克隆形成率8、 细胞生长曲线：接种培养计数制图； 曲线近似“S”形，潜伏期对数生长期平台期； 生长曲线反映的是某一特定培养条件下的细胞增殖规律。第2章 肿瘤细胞1、 癌基因的产物：原癌基因的产物主要包括：生长因子，如sis，生长因子受体，如fms、erbB，蛋白激酶及其它信号转导组分，如src、ras、raf，细胞周期蛋白，如bcl-1，细胞凋亡调控因子，如bcl-2，转录因子，如myc、fos、jun。2、 原癌基因的描述判断：原癌基因是细胞内与细胞增殖相

3、关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。3、 P53基因描述：转录调节因子；使癌细胞凋亡，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。4、 肿瘤细胞体外培养的生物学特性： 形态和性状（形态不规则，界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富|折光性强，表面微绒毛多） 生物特性（营养要求不高，自分泌促增长因子，生长方向性消失、失去接触抑制，细胞倍增周期短） 永生性、侵润性、异质性、细胞遗传性。第3章 污染控制、冷冻保存1、 细菌、真菌污染的控制：过滤除菌（0.22 µ

4、;m）、抗生素（预防用药：双抗生素-青霉素，链霉素，真菌：两性霉素B；污染后清除用药（在污染早期可能有效）：需采用大于常用量5-10倍的冲洗法，于加药后作用24-48小时，再换常规培养液。）2、支原体污染的用药控制：抗生素（Cip，BM-1+BM-2，M-plasmocin）方便经济有效、加温处理、支原体特异的抗血清3、细胞冻存和复苏的方法步骤：冻存：常规技术消化并收集细胞于离心管中离心；去上清，逐滴加入4预冷的冻存液，轻轻重悬细胞后，均匀分装于冻存管中，做好标记；尽快将冻存管装于纱布袋中，悬于液氮液面上方或低温冰箱（-70）过夜；次日转入液氮中。复苏：从液氮罐中取出冻存管迅速放入38 水浴中

5、，并不时摇动，在1分钟内使细胞完全融化无菌条件下逐滴转移至加有适量培养液的离心管中根据细胞的要求离心，弃上清加入适量培养液，轻轻重悬细胞，接种培养过夜（接种浓度一般<106/ml）次日更换培养液，继续培养，并观察生长情况。第4、 五章 1、 病毒感染细胞测定方法：检验标本杀灭杂菌（青、链霉素）检测病毒的存在：接种易感的动物出现病状； 鸡胚病变或死亡； 细胞培养细胞病变鉴定病毒种型（血清学方法）。 繁殖指征 （1）细胞致病作用（Cytopathic effect, CPE） （2）红细胞吸附现象（Hemadsorption phenomenon） （3）干扰现象（Interference

6、phenomenon） （4）包涵体（Inclusion body）形成（5）代谢生长抑制（Growth inhibition）（6）细胞转化、出现“转化灶”（Transformation）二、免疫酶染色法1、 病毒感染细胞的检测方法：免疫酶染色法：链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（SABC法）；灵敏性高，对比度佳。2、免疫酶染色法原理Step 1：特异性第一抗体+组织细胞标本共孵育；Step 2：通过生物素化第二抗体与第一抗体结合；Step 3：借助亲和素与生物素的天然亲和性，将多个生物素化辣根过氧化酶连接为一个ABC复合物；Step 4：复合物中亲和素结合二抗上的生物素，介导ABC

7、复合物结合到抗原抗体复合物上。加入显色底物后，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。3、 免疫酶染色法主要材料： （1）磷酸盐缓冲液洗涤 （2）Tris-HCl缓冲液-配制底物溶液 （3）底物溶液（现配现用）-显色 （4） ABC试剂盒（二抗+ABC复合物）-包含所需的专用试剂 （5）抗体（一抗）-结合标本中特定的抗原 （6）器材4、 基本步骤：细胞准备与固定过氧化氢处理PBS振洗封闭一抗标记振洗+二抗标记振洗+ABC复合物振洗细胞核衬染逐级脱水透明封片5、 注意事项：对照设置、DAB显色、封片与脱水二、传代细胞生长过程的分期：游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）三、转化细胞的特征及检

8、测方法1、特征：遗传性状改变2、检测方法：四氮唑盐（MTT）比色法（细胞活性）、流式细胞术（测定DNA合成）、3H-TdR掺入法、PCR、细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法）、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入实验第6、 七章 细胞调亡、大规模培养1、 细胞坏死概念：细胞非正常死亡，由于细胞内含物释放到细胞外，导致炎症。细胞坏死被认为是因病理而产生的被动死亡。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。2、 细胞大规模培养需要控制的要素： （1）动物细胞培养的环境：温度、pH值；（2）营养成分；（3）溶解氧；（4）渗透压等其他因素 天然培养基

9、：优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。 合成培养基：既能提供一个近拟于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。 第8章 细胞融合1、 细胞融合剂： （1）仙台病毒：凝血活性和唾液酸苷酶活性 优点：适用范围广，病毒易培养。 缺点：制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率低、病毒对细胞的生命活动产生干扰。 适用于动物细胞融合，用于实验室研究。 （2）聚乙二醇：PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，在质膜之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连,进而促使质膜的融合。PEG能增加类脂膜的流动性。

10、 优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 （3）电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小。 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程。 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。2、 细胞融合的具体步骤：（1）细胞准备：贴壁细胞，两亲本细胞混合培养；悬浮细胞，制成一定浓度的细胞悬浮液。（2）细胞融合：加融合剂于待融合细胞中，诱导融合。（3）杂种细胞选择：利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，杂种细胞存活。（4）杂种细胞克隆：对选出的杂种细胞进行克隆，培养出所需要的无性繁殖系。3、细胞

11、融合的意义：任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，从而对物种资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。4、单克隆抗体的定义：由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的结构与功能完全相同的同源抗体。优点：以标记抗体为特点的免疫学方法缺点：不能进行沉淀和凝集反应免疫反应：多抗优于单抗；抗原鉴定,特异诊断：单抗优于多抗5、

12、制备单克隆抗体的技术和过程： 技术：细胞融合技术、融合细胞筛选技术、 过程：融合前的准备工作 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的扩增、冻存和克隆化 单克隆抗体的大量制备 第9章 核移植，动物克隆第十章 转基因动物与生物反应器1、 转基因动物生物反应器：2、 转基因技术方法：电穿孔法（简单、效率较高）、显微注射法（随机，基因重排、易位、缺失或定点突变）、裸露DNA直接注射、磷酸钙DNA共沉淀法（转移效率低）、脂质载体包埋法（效率高）、病毒介导的生物学方法3、 培育转基因动物的方法：基因的显微注射法、胚胎干细胞方法、反转录病毒法4、 乳腺生物反应器：制备：（1）表达载体的构建：启动子调控元件

13、选用动物乳蛋白基因启动子元件；（2）目的基因的选择；（3）体外重组；（4）基因转导；（5）胚胎移植；（6）鉴定优点：产品质量稳定、产品成本低、研制开发周期短、无污染、经济效益显著问题：（1）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分离和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题 （6）伦理道德问题 第十一章 胚胎工程1、xy差别性别控制原理和依据： 原始生殖细胞 (Primordial germ cells，PGCs) :就是指能发育为精子或卵子的祖先细胞。在迁移过程中PGCs不断分裂增殖，随胎龄增长，性别发生分化，在雄性

14、，生殖嵴演变为睾丸，PGCs形成精原干细胞，而后附着在生精细胞上皮进入精子发生过程；在雌性，生殖嵴演变为卵巢，PGCs分裂形成卵母细胞 。生殖细胞经过增殖期、生长期和成熟期,最终形成精子和卵子。睾丸的发生：若胚胎细胞的性染色体为XY时，Y染色体短臂上有睾丸决定因子，此因子使未分化性腺向睾丸发育卵巢的发生：若胚胎细胞的性染色体为XX时，则未分化性腺自然向卵巢方向分化2、 皮质反应与透明带反应：精卵融合时，诱导卵膜特性发生改变，可阻止第二个精子进入卵内，这一机制称为卵膜封闭。同时，激活后的卵胞浆排出的皮质颗粒可通过诱导透明带反应，也可以拒绝其他精子的通过。 皮质颗粒胞吐，颗粒内容物扩散至细胞表面和

15、透明带，阻止多精受精。3、体外受精：体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。它的基本原理是人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、PH等，使卵丘卵母细胞复合体的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。 过程： 1、卵母细胞的采集和成熟培养 （1）卵母细胞的采集 （2）卵母细胞的选择 （3）卵母细胞的成熟培养2、精子的获能处理第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子，增强了膜通透性。第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。方法：自然交配法、雌性生殖道、人工配制3、 体外受精常规体外受精技术、与分离精子相结合的体外受精技术（预选性别）、显

16、微受精技术4、受精卵的体外培养发育阻滞：体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为发育阻滞。克服发育阻滞现象：一是改进培养液成分，二是利用体细胞共同培养体系5、 胚胎移植4、胚胎分割：将一枚胚胎用显微手术的方法分割成两份、四份，甚至八份，经体内或体外培养，然后移植于受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术特点:后代具有相同的遗传物质“克隆”胚胎:发育良好的,形态正常的桑椹胚或囊胚仪器：实体显微镜和显微操作仪原理：根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点注意事项：对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割。胚胎分割的份数越多，操作的难度会越大，移植

17、的成功率也越低。5、胚胎移植（embryo transfer）也称受精卵移植，是指一头母畜（称为“供体”）发情排卵并经过配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的输卵管或子宫角。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。胚胎移植的基本原则1.胚胎移植前后所处的环境的同一性n 供体和受体在分类学上的相同属性n 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性n 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性2.胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内 3.胚胎的质量：

18、胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响胚胎移植的技术程序1.供体、受体的选择2.超数排卵（促性腺激素）3 同步发情（前列腺素处理法：有溶黄体作用；孕激素处理法：造成人为黄体期；促性腺释放激素和促性腺激素类）4.人工受精5.胚胎采集（胚胎冲洗液的配制：PBS、SOF；手术法收集胚胎：输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 子宫角冲胚，非手术法收集胚胎：二路法、三路法）6.胚胎的检查与鉴定7.胚胎移植（手术法移植非手术法移植） 手术法移植（可绑定的动物）：输卵管移植、子宫移植 对象：移植卵裂早期的胚胎 非手术法移植（牛胚胎移植）：用人工受精管，通过子宫颈进入子宫体，胚胎移植枪插入子宫角深部注入

19、胚胎 胚泡阶段：发情6-9天8. 供体和受体的术后观察及处理6、 胚胎冷冻 方法：常规冷冻法（2h内）、一步冷冻法（脱水）、玻璃化法 冷冻剂：细胞内液抗冻保护剂:常用低分子量可渗物质，如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(GLY)、二甲基亚砜(DMSO)等; 细胞外液抗冻保护剂:常用低相对分子质量不可渗物质，如半乳糖、蔗糖、海藻糖、聚蔗糖等。7、动物的性别控制是指通过人为干预，使动物按人们的愿望繁衍所需性别后代的技术。是指通过人为干预，使动物按人们的愿望繁衍所需性别后代的技术。 性别控制技术将成为胚胎工程中的一项配套技术，对各项生物技术的发展和应用都具有重要的促进作用。 三种性别决定方

20、法：1.性染色体与性别决定a 雄性异配子型；b 雌性异配子型;c 雄性单倍性型。(1)雄性异配子型雄性异配子型中，雌性动物只产生一种类型的配子，雄性动物则产生两种不同类型的配子，主要包括XY型和XO型。(2)雌性异配子型与雄性异配子型正好相反，其雄性动物只产生一种类型的配子，而雌性动物则产生两种不同类型的配子，主要包括ZO型和ZW型。(3)雄性单倍性型动物没有性染色体由卵细胞受精与否决定其性别。卵细胞不经受精而行孤雌生殖直接发育的个体为雄性，卵细胞经受精后发育而成的个体为雌性。 2. Y染色体性别决定区基因SRY 哺乳动物的Y染色体上有一个性别的遗传控制因子，称为睾丸决定因子 睾丸决定因子（TDF)是哺乳动物的染色体上的一个性别的遗传控制因子。Y染色体性别决定区基因（SRY）性别决定是涉及多个基因的级联调控过程3.环境对性别的影响第十二章 干细胞与组织工程1、定义：干细胞是具有自我更新和多项分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞