壳聚糖_聚乙二醇接枝共聚物的合成与表征

1、第37卷第2期2005年3月四川大学学报(工程科学版)JOURNALOFSICHUANUNIVERSITY(ENGINEERINGSCIENCEEDITION)Vol.37No.2Mar.2005文章编号:100923087(2005)0220076204壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物的合成与表征孙毅毅,侯世祥,陈彤,何军,袁子雁(四川大学华西药学院,四川成都610041)摘要:用1,1羰基二咪唑活化MPEG法制备活化MPEG,再用活化MPEG与壳聚糖上的伯氨基反应,两步法合成了壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物。用FT-IR、H-NMR对共聚物的结构进行了表征,分别用重量法、间接法及1H-NMR测定了接

2、枝率约为11%,符合经典隐形纳米粒材料的PEG含量。用X-射线衍射及证明了聚合物的结晶度有所增强,有望作为隐形纳米粒的载体材料使用础。关键词:壳聚糖;单甲氧基聚乙二醇;接枝共聚物;中图分类号:TQ322.9SynthesisofGraftCopolymerofChitosanandPolyethyleneGlycolSUNYi2yi,HOUShi2xiang,CHENTong,HEJun,YUANZi2yan(WestChinaSchoolofPharmacy,SichuanUniv.,Chengdu610041,China)Abstract:MPEGwasmodifiedwith1,1-ca

3、rbonyldiimidazole,thentheactivatedMPEGreactedwithprimaryaminogroupsofchitosan.Synthesizethegraftcopolymerofchitosanandpolyethyleneglycolintwosteps.ThestructureofthecopolymerwascharacterizedbyFT-IRandH-NMR.Thegraftratewasdeterminedtobe11%withgravimetry1method,indirectmethodandH-NMR.ItagreeswiththePEG

4、contentofclassicalstealthnanoparticlesmaterials.TheX2raydiffractionandDSCanalysesprovedthatthecrystallinityofthecopolymerincreased.Itisapromisingmaterialforthestealthnanoparticles.Itisapotentialnewcarrierforthedrugdeliverysystemsoflong2circulationandsolidcarci2noma.Keywords:chitosan;MPEG;graftcopoly

5、mer;stealthnanoparticles;carriermaterial药剂学范畴的纳米粒(nanoparticles,NP),是指粒径大小介于101000nm的固态胶体粒子。普通NP经静脉注射后,被肝脏等吞噬细胞丰盈的组织吞噬而从血中快速清除,因此NP多作为肝靶向给药系统的载体。但需要将药物靶向于肝脏以外的器官或组织(尤其是肿瘤组织)时,则需成为“隐形NP”而避开肝脏巨噬细胞的吞噬并延长在血液中的循环时间。通过在普通NP的表面物理吸附或共价结合一收稿日期:2004209228作者简介:孙毅毅(19732),女,博士生.研究方向:药物化学.层或多层亲水性的高分子材料如聚乙二醇(PEG)

6、、单甲氧基聚乙二醇(MPEG)、聚氧乙烯(PEO)、Polox2amer、poloxamine、聚山梨酯80等手段,达到将NP隐形的目的,可使包载到该NP中的药物具有比普通NP和原药更长的血浆半衰期,因此又称为“长循环”(long-circulating)或(stericallystablized)“空间稳定”NP1。由于吸附型隐形NP在体内循环时具有表面的亲水性高分子材料易于脱落等缺点,共价结合型隐形NP载体材料的合成和应用研究越来越广泛,“隐形NP”及其材料的研究目前已逐渐成为国内外纳米给药系统研究中活跃的热点领域。但材料的研第2期孙毅毅,等:壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物的合成与表征77究主

7、要集中在合成聚合物如聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PHDCA)2、聚氰基丙烯酸酯(PCA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)3等与亲水性高分子材料的共聚物上,而天然高分子材料壳聚糖(chitosan,CS)为抗肿瘤药物普通NP的常用载体材料,生物相容性、生物可降解性及肿瘤亲和性好,毒性低,具有合成高分子材料无法比拟的优势。本研究采用两步法制备壳聚糖-聚乙二醇(CS-MPEG)接枝共聚物,以获得可应用于人体的、非肝脏靶向“隐形NP”和高肿瘤趋向性NP的低毒载体材料。1.3壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物的合成与表征1.3.1壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物的合成将适量CS与MP

8、EG-CDM溶于0.7%HCl溶液中,37搅拌18h后,冷至室温,滴加0.5mol/LNaOH至pH78,冰水浴中搅拌下滴加丙酮-无水乙醚(12)沉淀产物,G4玻砂漏斗抽滤,冷水-丙酮(110)适量洗涤沉淀,80真空干燥后称定重量。合成CS-MPEG的反应方程为:1实验部分1.1实验试剂与仪器壳聚糖(CS,粘均分子量200000D、脱乙酰度>99%),浙江玉环海洋生物化学有限公司;聚乙二醇5000(MPEG5000,简写作)Aesar;1,1-),AR,AR试剂。85-2,上海司乐仪器1.3.2壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物接枝率的测定分别用重量法与两相体系分光光度间接法6测定。1.3.3壳

9、聚糖-聚乙二醇接枝共聚物的结构表征1通过FT-IR、H-NMR对所合成的CS-MPEG厂;UV-2201型紫外分光光度计,日本岛津;傅里叶变换红外光谱仪,美国NICOLET;元素分析仪,意大利CARLOERBA;UnityINOVA-400/54型高分辨超导核磁共振仪,美国瓦里安;X射线多功能粉末衍射仪,荷兰菲利浦;差示扫描量热仪,德国NETZSCH。1.2活化单甲氧基聚乙二醇5000的合成与表征1.2.1活化单甲氧基聚乙二醇5000的合成进行验证;X-射线衍射和DSC分析进一步考察产物的性质。2结果与讨论2.1MPEG-CDM的结构表征借鉴蛋白质PGE化常用的、反应条件温和的1,1羰基二咪唑

10、活化MPEG法制备活化MPEG。参考Beauchamp等4,5的方法并进行改进:将适量MPEG和CDM溶于二氧六环-二甲亚砜(21)中,37搅拌18h后,冷至室温,冰水浴中搅拌下滴加无水乙醚沉淀产物,过滤,用冷二氧六环-二甲亚砜-无水乙醚(213)洗涤2次,再用冷无水乙醚洗涤3次,真空干燥后备用。MPEG活化反应如下:试验所采用的CDM活化MPEG的反应为目前较为成熟的氨基酸或蛋白质PEG化的第一步反应,反应机理明确,反应产物结构确定,故仅以IR及元素分析确证其结构,未再做其他方法的结构鉴定与表征。2.1.1元素分析对所得的MPEG-CDM作C、H、N元素分析,结果见表1。以元素N的实测含量与

11、理论含量的相对值表示MPEG的活化度,合成多批MPEG-CDM,活化度均在104%左右。表1MPEG-CDM的元素分析Tab.1ElementaryanalysisofMPEG-CDMElementCTheoriticalvalue/%54.369.040.55Observedvalue/%54.429.170.571.2.2活化单甲氧基聚乙二醇5000的结构表征HN合成产物经元素分析、FT-IR确证结构。782.1.2红外光谱分析四川大学学报(工程科学版)第37卷35。经FT-IR检测,反应产物3400cm-1左右的-1出现明显的-C=O,说明OH消失,并在1762cm活化完全。由元素分析与

12、FT-IR结果可见,该步所合成的化合物为目标化合物。2.2MPEG-CDM的合成与活化度该步反应改用二氧六环-二甲亚砜(21)为溶剂,较文献报道的以二氧六环或丙酮为溶剂4,5的活化度高,分析原因,可能系该复合溶剂为反应物的良溶剂,使反应更加完全;同时MPEG原料中可能混有部分PEG,使测定的活化度高于100%。2.3CS-MPEG的测试与结构表征2.3.1红外光谱分析CS与CS-MPEG的FT-IR图谱见图1、图21590cm-1是CS的NH2面内弯曲振,-MPEG中的NH2图3CS的1H-NMR图谱1Fig.3H-NMRspectrumofCS发生在CS的cm-1范围内的CS,说明C6和C3

13、。图4MPEG的1H-NMR图谱1Fig.4H-NMRspectrumofMPEG图1CS的FT-IR图谱Fig.1FT-IRspectrumofCS图5CS-MPEG的1H-NMR图谱1Fig.5H-NMRspectrumofCS-MPEG图2CS-MPEG的FT-IR图谱Fig.2FT-IRspectrumofCS-MPEG12.3.2H-NMR的测定CS、MPEG及CS-MPEG的1H-NMR谱图见图图3中,对照CS的标准图谱,由于受溶剂的干扰,仅可见CS的3.88(3H,-CH)、3.69(5H,-CH)和3.14(2H,-CH)共振吸收峰重叠较少,易于分辨。图4中,MPEG的共振吸收

14、峰可见3.51(CH3)、3.45(CH2)和3.37(CH2)易于分辨。图5中,CS-MPEG的共振吸收峰可见3.48(MPEG-CH2)、3.41(MPEG-CH2)、3.19(2H,CS-CH)易于分辨,其中,尤以3.41(MPEG-CH2)分离较好,故可用3.19(2H,CS-CH)与3.41(MPEG-CH2)的峰面积比计算得到CS-MPEG的接枝率:A/2接枝率=×100%=10.95%。A3.19第2期孙毅毅,等:壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物的合成与表征79由FT-IR及1H-NMR结果可见,确证合成的CS-MPEG为目标化合物。2.3.3X-射线衍射分析CS、MPEG、

15、MPEG-CDM及CS-MPEG的X-射线衍射图谱见图6。从图中可见,MPEG与MPEG-CDM的谱图基本一致,但与CS和CS-MPEG均有(173.6J/g)不变,但63.1的MPEG吸热峰左移至57.2(峰面积243.6J/g),同时MPEG在49.9的特征冷结晶放热峰消失,说明化合物并非二者的简单物理混合物,且游离MPEG分离较完全。按接枝率10.95%计算,CS与MPEG吸热峰的理论峰面积之和为156.8J/g,远小于CS-MPEG中的CS与MPEG峰面积和(417.2J/g),说明合成的CS-MPEG的结晶度较CS与MPEG高,与X-射线衍射的结果一致。2.4CS-MPEG的合成与接

16、枝率带NH2化合物聚乙二醇化的文献报道测定方法有三硝基苯磺酸法(TNBS、凝胶渗透色谱(G、)、基体辅助激光解、傅利叶变换红外(-)-),TNBS法。该法,通过确定NH2减少的数目来计算活化程度或修饰度,但溶液中NH2被掩盖或TNBS无法接近自由氨基位点,则此法测定准确度差,同时TNBS法测量精度还受到聚乙二醇的干扰,需先分离出游离的聚乙二醇再测定6。且此法需要在碱性条件下进行定量反应,如果反应物不溶于碱性溶液(如CS),则测定无意义。我们参考文献,采用两相体系分光光度法测定游离聚乙二醇含量后,再间接计算接枝率的方法,经考察,CS、CDM和CS-MPEG均不干扰测定。经多批样品测定,间接法、重

17、量法与1HNMR测定结果一致,均为10%11%,故二法均为该聚合物接枝率测定的适宜方法。角为31.7°较大差异:CS-MPEG在2和56.5°分别出现两个CS和MPEG均没有的衍射峰,晶面间距d分别为0.28nm(相对丰度23.3%)和0.16nm(相对丰度3.7%),同时,CS-MPEG中45.2°的衍射峰相对丰度,由MPEG中的1.85%增强为14.3%。说明合成的新的化合物由于引入了MPEG,分子内形成了新的氢键,使壳聚糖大分子原有的结晶和有序结构发生了改变,结晶度有所增加,溶解度降低,说明该材料较CS更有利于用共沉淀等法制备NP。A.CS;B.MPEG;C

18、.MPEG-CDM;D.CS-MPEG图6X-射线衍射图谱Fig.6X2raydiffractiondiagrams2.3.4DSC分析取CS、MPEG、CS与MPEG的简单混合物及CS-MPEG作差示扫描量热分析,结果见图7。3结论采用的两步法合成的隐形纳米粒的载体材料CS-MPEG接枝共聚物,所采用的原料CDM在第二步合成中易于除去,且所用的有机溶剂可全部除去,故该接枝共聚物具有纯度高、毒性小的优势,使其最终应用于体内成为可能。接枝率约为11%,即CS的每9个-NH2结合一个MPEG。根据CS的螺旋结构7,经计算CS-MPEG接枝共聚物的单侧A.CS;B.MPEG;C.Physicalmi

19、xtureofCSandMPEG;D.CS-MPEG图7DSC图谱Fig.7DSCspectra由图可见,简单混合物中,100.9的CS吸热峰(峰面积173.8J/g)和63.1的MPEG吸热峰(峰面积151.0J/g)的峰位置及峰面积均无变化;CS-MPEG中,100.9的CS吸热峰位置及峰面积每两个MPEG之间的距离为1.5nm。而要产生有效的立体稳定作用以避免人多型核白细胞的摄取,从而实现体内长循环的经典隐形纳米粒材料,其表面相邻两条PEG链的距离应为1.5nm3,故所合成的CS-MPEG接枝共聚物符合经典隐形纳米粒材料的PEG间距(即PEG的含量),说明该材料有望达到(下转第104页)

20、104四川大学学报(工程科学版)1999.95100.第37卷2SmithRG.Thecontractnetprotocol:high2levelcommunicationandcontrolinadistributedproblemsolverJ.IEEETransac2tionsonComputers,1980.11041113.3OhkoT,HirakiK,AnzaiY.Reducingcommunicationloadoncontractnetbycase2basedeavesdroppingforutilizingmessageleakageA.IEEEProcIROSC.1997.

21、14301436.4OhkoT,HirakiK,AnzaiY.LEMMING:alearningsystemformulti2robotenvironmentsA.ProceedingsoftheIEEE/RSJIn2ternationalConferenceonIntelligentRobotsandSystemsYoko2hamaC.Japan,1993.2630.5DeshpandeU,GuptaA.PerformanceinprovementofthecontractnetprotocolusinginstancebasedlearningJ.IWDC2003,LNCS,2003,29

22、18:290299.6SimKM.Simulationofamulti2agentprotocolfortaskincooperativedesignJ.IEEETCom7DirG,LangholzG.MatchingattributeinafuzzycasedreasoningA.NAFIPS,1999.3336.8ZhangJianhong,WangJilin,WangYumin.Anon2repudiationprotocolbasedonbulletinboardJ.JournalofElectronices&InformationTechnology,2004,26(2):3

23、22325.张键红,王继林,王有良.一种基于公告牌的反抵赖协议J.电子与信息学报,2004,26(2):322325.9YANGKun,LIUDayou,GUOXin.AtemplatearchitectureformobileagentsystemofhighsecurityJ.JournalSoftware,2002,13(1):130135.杨,郭欣.一个具有安.计算机学报,2002,(编辑杨蓓)(上接第79页)“隐形”的目的。综上,所合成的CS-MPEG接枝共聚物有望作为隐形纳米粒的载体材料使用,并为长循环及实体瘤给药系统研究提供新的载体奠定了基础。参考文献:1WangYang,WuW

24、ei.ThetargetingofstealthnanoparticlesinvivoJ.ChinesePharmaceuticalJournal,2004,39(1):711.汪杨,吴伟.隐形纳米粒的体内靶向性J.中国药4CharelsO,BeauchampS,StevenL,etal.Anewprocedureforthesynthesisofpolyethyleneglycol2proteinadducs;effecsonfunction,receptorrecognition,andclearanceofsuperoxidedismu2tase,lactoferrin,and2-macroglobulinJ.AnalyticalBiochem2istry,1983,131(1):2533.5LiWeijun,ZhengChunhui,ZhangDalei,etal.Modificationofbovineserumalbuminwithpolyethyleneglycolderivativeandre2latedanalysistechniquesJ.Le