三种抗血小板药物在体外对血小板活化的 抑制作用研究

1、论著基金项目:国家卫生部科学研究基金资助项目(96212261作者单位:100034北京大学第一医院检验科三种抗血小板药物在体外对血小板活化的抑制作用研究王建中曹凌袁家颖王淑娟【摘要】目的探讨阿司匹林、噻氯匹啶和西洛他唑三种药物在体外对血小板活化的抑制作用。方法流式细胞术三色分析三种抗血小板药物在体外对活化血小板膜表面纤维蛋白原受体(FI B 2R 和P 2选择素(C D62P 表达的抑制作用。结果三种药物对ADP 活化血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表达的抑制作用明显不同,西洛他唑能显著抑制FI B 2R 和C D62P 的表达;噻氯匹啶抑制FI B 2R 表达的作用显著,但对C

2、 D62P 表达的抑制较小;阿司匹林对FI B 2R 和C D62P 表达的抑制作用较差。结论与阿司匹林、噻氯匹啶相比,西洛他唑是一种较强的抗血小板活化药物,既可抑制FI B 2R 的表达而降低血小板的聚集性,又可抑制血小板的释放反应而降低其促凝血活性,在血栓性疾病的防治中有重要作用。【关键词】阿司匹林;血小板活化;流式细胞术Study on the action of three kinds of anti 2platelet drugs for in vitro inhibiting platelet activation WANG Jianzhong,C AO Ling ,YUAN Ji

3、aying ,WANG Shujuan.Peking Univer sity Fir st Hospital ,Beijing 100034,China【Abstract 】Objective T o study the action of aspirin ,ticlopidine and cilostazol in inhibiting platelet activation in vitro.Methods Three kinds of anti 2platelet drugs ,which inhibited the expression of fibrinogen receptor (

4、FI B 2R and P 2selectin (C D62P on activated platelets surface in vitro ,were analyzed by tri 2color flow cytometry.R esults Three kinds of anti 2platelet drugs inhibited the expression of FI B 2R and C D62P on ADP activating platelet membrane surface differently.Cilostazol could inhibit the express

5、ion of FI B 2R and C D62P of the platelets markedly.T iclopidine could inhibit the FI B 2R expression markedly ,but C D62P indistinctly.Aspirin could not inhibit the expression of either FI B 2R and C D62P on ADP activating platelets.Conclusion Cilostazol is a strong anti 2platelet drug as compared

6、with aspirin and ticlopidine.It could not only inhibit FI B 2R expression of activated platelets ,which can prevent platelet aggregation ,but als o decrease the release reaction and procoagulative activities of activated platelets.【K ey w ords 】Aspirin ;Platelet activation ;Flow cytometry血栓栓塞性疾病是当前危

7、害人类健康,导致病死率最高的原因之一。预防血栓形成(防栓,治疗血栓形成(治栓,将已形成的血栓溶解(溶栓,已成为当前临床上重要的防治方法1。血小板活化水平增高是导致血栓形成的重要因素。血小板的活化功能虽然对于止血是必不可少的,但其活化水平增高也是许多疾病,包括心肌梗死、卒中和不稳定型心绞痛的重要发病机制2,3。有效的抗血小板药物对于防栓、治栓是极为重要的。然而,目前常用的抗血小板药物对血小板活化的抑制作用仍不十分清楚。血小板活化的特征是形态改变、纤维蛋白原受体(FI B 2R 表达和颗粒内含物的释放,从而导致血小板聚集和血小板血栓形成2。本研究通过体外试验,观察阿司匹林、噻氯匹啶和西洛他唑三种最

8、常用的抗血小板药物对活化血小板膜表面FI B 2R 和P 2选择素(C D62P 分子表达的抑制作用,进一步探讨其抗血小板活化的机制,为临床更有效的选择抗血小板活化药物提供依据。材料和方法一、主要试剂与仪器11抗血小板药物:西洛他唑(cilostazol ,原料药,中国大冢制药公司提供。噻氯匹啶(ticlopidine ,原料药,法国赛洛菲制药公司提供。阿司匹林(aspirin ,原料药,Baker 公司产品。21试剂:单克隆抗体(McAb ,异硫氰酸荧光素 A 1阴性对照;B 11010m ol/L ;ADP 活化血小板图1流式细胞术三色分析血小板活化荧光散点图(FITC 标记的抗血小板纤维

9、蛋白原受体(FI B 2R 的McAb (PAC 21FITC 。藻红蛋白(PE 标记的抗血小板P 2选择素(C D62P PE ,又称颗粒膜蛋白2140(G MP 2140的McAb 。Peridinin 叶绿素蛋白(peridinin chlorophyll protein ,PerCP 标记的抗血小板膜糖蛋白a 的McAb (C D61PerCP 。藻红蛋白标记的鼠免疫球蛋白G (MIgG 1PE 。以上均为美国BD 公司产品。二磷酸腺苷(ADP ,美国Sigma 公司产品。RG DS 肽(FI B 2R 阻断剂,人工合成的精氨酰2甘氨酰2天冬氨酰2丝氨酰多肽(RG DS 肽,配成5mg

10、/ml H 2O ,美国Sigma 公司产品。31流式细胞仪:FACS ort 型,美国BD 公司产品。二、方法11采血:取5名正常人空腹静脉血,用106mm ol/L 枸橼酸钠真空抗凝管(美国BD 公司产品抗凝,血液与抗凝剂比例为91。21药物与血小板作用:西洛他唑用N 1N 2二甲基酰胺(DMF 溶解,噻氯匹啶用生理盐水溶解,阿司匹林用无水乙醇溶解,分别配制成20000、10000、2000、1000、200m ol/L ,各取5l ,分别加入445l 立即采集的抗凝血中轻轻混匀,置室温10min 。另取各三种溶剂5l 作为对照,同上述操作。31ADP 活化血小板:在上述加入西洛他唑、噻氯

11、匹啶和阿司匹林的血液中各加入50l ADP (30m ol/L 并轻轻混匀,置37激活5min 。41荧光素标记的抗血小板单克隆抗体免疫荧光染色:在阴性对照管中加PAC 21FITC 、RG DS 10l (5mg/ml 、MIgG 1PE 和C D61PerCP 各10l ,在测定管中加PAC 21FITC 、C D62P PE 和C D61PerCP 各10l ,再分别加入各种浓度药物作用后并经ADP 活化的血液5l 混匀,置室温、避光反应20min ,立即加入110ml 1%多聚甲醛(26混匀,4冰箱保存,24h 内在流式细胞仪上分析。51流式细胞术(FC M 三色分析血小板:将上述用荧

12、光素标记的抗血小板单克隆抗体免疫荧光染色的标本在流式细胞仪上分析,以C D61PerCP/SSC 双参数设定血小板门,分析FI B 2R (PAC 21和C D62P 阳性血小板(见图1百分率及其相对表达量(平均荧光强度,MFI 。三、抑制率计算各种不同浓度药物和溶剂对照的血液标本,经FC M 分析获得PAC 21和C D62P 阳性血小板百分率及其相对表达量(平均荧光强度,按下式计算ADP 活化血小板表面FI B 2R 和C D62P 表达受药物的抑制率。抑制率(%=1-阳性血小板百分率×平均荧光强度(浓度药物阳性血小板百分率×平均荧光强度(溶剂对照×100%结

13、果11ADP 激活血小板膜糖蛋白变化:用不同浓度ADP (0、011、012、015、110、210、510、1010、2010m ol/L 加入正常人抗凝血液中轻轻混匀,37激活5min 后测定血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 阳性血小板百分率和平均荧光强度(MFI ,发现011m ol/L ADP 可致血小板明显活化,其中部分荧光直方图比较见图2和图3,1010m ol /LADP 即可使活化血小图2不同浓度ADP 活化血小板膜纤维蛋白原受体(PAC 21表达荧光直方图比较板膜表面FI B 2R 和C D62P 表达至峰值,FI B 2R 和C D62P 阳性血小板百分率分别为(

14、89±6%和(84±8%。在上述浓度ADP 激活的血液标本测定管中分别加入1010l RG DS 后再测定血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 阳性血小板百分率和MFI ,发现RG DS 能竞争性抑制McAb PAC 21与活化血小 图3不同浓度ADP 活化血小板颗粒膜蛋白CD62P 表达荧光直方图比较板膜FI B 2R 的结合。21西洛他唑、噻氯匹啶和阿司匹林对活化血小板膜表面纤维蛋白原受体表达的抑制作用比较:5名正常人血液标本与不同浓度西洛他唑、噻氯匹啶或阿司匹林作用后,经ADP 活化血小板膜表面纤维蛋白原受体和C D62P 表达的平均抑制率变化见图4和图5 。图

15、4三种抗血小板药物对活化血小板表面纤维蛋白原 受体表达的抑制作用比较图5三种抗血小板药物对活化血小板表面CD62P 表达的抑制作用比较讨论血小板可被多种因素激活,其活化的机制也不尽相同,但最终都是使血小板膜表面暴露纤维蛋白原受体(FI B 2R 并与纤维蛋白原结合使血小板聚集,从而导致血小板血栓形成。活化血小板胞浆中颗粒如颗粒等发生脱颗粒反应,颗粒内含物释放至血液中促进血栓形成,而颗粒膜蛋白如P 2选择素(C D62P 则暴露于血小板表面3。因此,本研究中选择FI B 2R 和C D62P 作为分子标志物,以流式细胞术(FC M 全血法、三色免疫荧光染色分析血小板活化水平3,4。从不同浓度的A

16、DP 激活的血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表达的动态变化可见,011m ol/L ADP 可致血小板明显活化,1010m ol/L ADP 即可使活化血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表达至峰值3。为了使药物对血小板活化的抑制作用观察更为灵敏,故选择310m ol/L ADP 浓度作为激活血小板的终浓度;ADP 活化血小板与FI B 2R 阻断剂(RG DS 作用后则不能与FI B 2R 的单克隆抗体(PAC 21结合3。以上结果表明,FC M 检测血小板表面FI B 2R 和C D62P 表达评价药物抗血小板活化作用具有较高的灵敏度与特异性。本研究结果表明,三种药物对

17、ADP 活化血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表达的抑制作用明显不同,西洛他唑能显著抑制FI B 2R 和C D62P 的表达;噻氯匹啶对FI B 2R 表达的抑制作用显著,但对C D62P 表达的抑制作用较小;阿司匹林对FI B 2R 和C D62P 表达的抑制作用较差。由此可见,西洛他唑是一种较强的抗血小板活化药物,既可抑制FI B 2R 的表达降低血小板的聚集性,又可抑制血小板的释放反应而降低其促凝血活性,从而起到防止血栓形成的作用。虽然西洛他唑作为一种较新的磷酸二酯酶抑制剂被美国食品与药品管理局(FDA 批准用于治疗间隙性跛行5,但其抗血小板活化作用对防栓、治栓可能更有价值。

18、K oda 等6发现西洛他唑可使猪颈动脉完全栓塞的时间明显延长、血小板聚集明显抑制,而噻氯匹啶既不能使猪颈动脉完全栓塞的时间延长,也对血小板聚集率抑制不显著,表明西洛他唑对于抑制颈动脉血栓形成和防止脑缺血发作有重要作用。噻氯匹啶通过阻止纤维蛋白原结合到血小板膜上的受体而抑制血小板聚集1,7。本研究表明噻氯匹啶对ADP 活化血小板膜表面FI B 2R 表达有明显的抑制作用,但对血小板释放反应的抑制作用小于西洛他唑。Y oon等8通过比较噻氯匹啶和阿司匹林(T +A与西洛他唑和阿司匹林(C+A组合应用于300例冠状动脉扩张术患者的治疗,其术后血栓和出血等并发症发生率两者无统计学意义,认为T+A与C

19、 +A在冠状动脉扩张后抗栓治疗具有同样的功效,但C+A更安全、不导致中性粒细胞减少。因此,西洛他唑有可能取代噻氯匹啶用于抗血小板活化治疗。阿司匹林是临床最常用的抗血小板活化药物,但在本次实验中发现对活化血小板膜表面FI B2R和C D62P表达的抑制作用较差,这有可能是由于阿司匹林抗血小板活化的机制与西洛他唑和噻氯匹啶不同所致。尽管阿司匹林在防止血管栓塞方面的作用已经被充分的肯定,可以降低卒中、心肌梗死等的危险性,但大约在10年前就已了解到噻氯匹啶比阿司匹林抗血小板活化更有效9。由于阿司匹林主要抑制血小板花生四烯酸代谢1,而噻氯匹啶则抑制血小板膜表面FI B2R表达,故这两种药物常作为一种标准

20、的组合应用于抗血栓治疗8。参考文献二版.上海:上海科学技术出版社,1996.3962412.2Fabre J E,Nguyen M,Latour A,et al1Decreased platelet aggregation, increased bleeding time and resistance to thromboembolism in P2Y12 deficient mice1Nut M ed,1999,5:119921202.4M ichels on AD1Flow cytometry:a clinical test of platelet function1 Blood,1996

21、,87:492524936.5C one J,W ang S,T andon N,et al1C om paris on of the effects of cilostaz ol and milrinone on intracellular cAMP levels and cellular function in platelets and cardiac cells1J Cardiovasc Pharmacol,1999,34:4972 504.6K odan N,T ani T,Nakayama S,et al1E ffects of cilostaz ol,a phosphodiest

22、erase III inhibitor,on experimental thrombosis in the porcine carotid artery1Thromb Res,1999,96:2612268.7Lechi C,G aino S,Andrioli G,et al,Decrease of platelet intracellular pH and adhesion by ticlopidine in patients with vascular disease1Int Angiol,1998,17:38242.8Y oon Y,Shim WH,Lee DH,et al1Useful

23、ness of cilostaz ol versus ticlopidine in coronary artery stenting1Am J Cardiol,1999,84:13572 1380.9Easton JD1What have we learned from recent antiplatelet trials1 Neurology,1998,51(3Suppl3:S36238.(收稿日期:2001205218(本文编辑:张莉读者来信建议统一应用抗生素的英文缩略语王金良国内期刊杂志(包括中华检验医学杂志抗菌药物的缩略字应用的不一致,给读者带来不便,也易发生误解。现建议统一应用美国临

24、床微生物学杂志(Journal of Clinical Microbiology稿约中抗生素的英文缩略语。左氟沙星(lev ofloxacin LVX;linezolid(LNZ;洛美沙星(lomeflaxacin LOM;loracarbef(LOR;美罗培南(meropenem ME M;甲氧西林(methicillin MET;美洛西林(mezlocillin MEZ;米诺霉素(minocycline MI N;拉氧头孢(m oxalactam M OX;莫西沙星(m oxifloxacin MXF;萘啶酸(nalidixic acid NA L;呋喃妥因(nitrofurantoin NIT;奈替米星(netilmicin NET ;诺氟沙星(norfloxacin NOR;氧氟沙星(ofloxacin OFX;苯唑西林(oxacillin OX A;青霉素(penicillin PE N;哌拉西林(piperacillin PFP;哌拉西林2他唑巴坦(piperacillin2tazobatam TZP;奎奴普汀2达夫普汀(quinu