蛋白质组学技术在烟草中的应用研究进展

1、蛋白质组学技术在烟草研究中的应用进展赵凤霞1,高相彬1,王正平1,李海峰2,宋学立1,冀敏31 河南省农业科学院烟草研究所,河南许昌 461000;2 河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450000;3 国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心,北京 100190摘要:综述了蛋白质组学作为后基因组时代功能基因组学研究的重要组成部分和前沿研究领域,在烟草研究中的应用进展,探讨了烟草根系、叶片等器官的蛋白质分离提取方法,蛋白质组学在低温、盐胁迫和机械损伤等逆境胁迫研究中的应用,烟株应对施肥、紫外线辐射、打顶和病害入侵等环境变化所发生的生理、病理反应的内在调控机制研究,以及蛋白质组学在提高烟叶品质

2、研究中的应用。最后提出了目前烟草蛋白质组学研究所面临的几个问题,并对下一步的研究和发展前景进行了展望。关键词:烟草;蛋白质组学;胁迫反应;调控机制中图分类号:TS413文献标志码:A文章编号:1004-5708(201401-0103-08Research and application of proteomics in tobaccoZHAO Fengxia1, GAO Xiangbin1, WANG Zhengping1, LI Haifeng2, SONG Xueli1, JI Min31 Tobacco Institute, Henan Academy of Agricultural

3、Sciences, Xuchang 461000, China;2 College of Bioengineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450000, China;3 Patent Examination Cooperation Center of the Pat e nt Office, Beijing 100190, ChinaAbstract: Proteomics and its application were considered as an important part of research frontier

4、 in functional genomics in post-geomic era. The following aspects were investigated such as protein separation and extraction method from tobacco roots and leaves, application of proteomics in stress research under low-temperature, salty and mechanically-damaged environment , regulation mechanism of

5、 physiological and pathological reactions when tobacco reponded to fertilization, ultraviolet radiation, decapitation and invasion of diseases,and application of proteomics in improving leaf quality. Issues of critical signi cance to current tobacco proteomics research were discussed and key researc

6、h areas and prospects were suggested.Keywords: tobacco; proteomics; stress response; regulation mechanism蛋白质组(proteome由蛋白质的“Prote”和基因组的“ome”字母拼接而成,指一个基因组或一类细胞、组织表达的所有蛋白质的总和1,由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年在意大利的一次电泳会议上首次提出。同基因组相似,蛋白质组为复杂发育过程中同时发生的蛋白质相关变化提供了重要的高通量研究手段2,与基因组相比,蛋白质组反映的是直接影响细胞生理生化变化的蛋白质。此外

7、,比较RNA的表达水平,蛋白质水平整合了转录后加工和翻译后加工的过程,而这些过程对细胞中最终产物的数量、定位和效率都会产生影响3。蛋白质组学是一项使用日渐广泛的研究方法,对两种不同的材料或处理,可以从蛋白质表达谱的宽度进行比较研究,揭示其中的内在机理。基于信号转导和代谢途径的上下游网络结构,使蛋白质组的研究不仅具有高通量的宽度,而且为生命过程的上下游节点研究提供了良好的基金项目:河南省博士科研启动基金项目(无编号;河南省烟草公司“河南省烟草产品质量安全标准制订” (HYKJ 201112作者简介:赵凤霞(1982,女,博士,助理研究员,主要研究方向为烟草生理生化。Tel:0374- 45180

8、06,通讯作者:高相彬(1982,男,博士,助理研究员,主要研究方向为烟草烘烤调制。Tel:0374- 4518006,收稿日期:2013-06-04机会。蛋白质组概念的提出,为科学家对于生命活动规律的研究开拓了新的领域。进行蛋白质组学研究是大势所趋,也是后基因组时代的重要研究前沿和热点领域4。蛋白质组学的主要研究内容为蛋白质间的相互作用、翻译后的修饰、蛋白质在不同部位、不同环境条件下以及生命过程不同阶段的表达等方面5,阐明组织、器官或者生物体全部或者部分蛋白质的表达模式及功能模式,揭示特定的生命现象和某些生命过程的内在机制,它是在更深层次上探索生命活动的规律和生理、病理现象。自1997年第一

9、篇植物蛋白质组学文章发表以来, 伴随着蛋白质组学技术体系的不断完善, 植物蛋白质组学发展迅速,多种植物组织(器官的蛋白质表达谱分析相继完成,植物不同发育阶段的蛋白质组变化,以及此过程中植物响应各种环境因子和逆境胁迫的差异表达蛋白质组也被大量报道6-8。烟草是我国重要的经济作物之一,具有悠久的栽培历史,其生产行业已经成为国民经济的一个重要组分, 也是一些地方省市的财政支柱。同时,烟草还是一种重要的模式植物,在植物遗传、发育和转基因等领域的研究中具有特殊意义。蛋白质双向电泳、质谱、酵母双杂交系统、蛋白质微阵列、支持大规模数据处理的计算机系统和软件、软电离以及生物信息学等蛋白质组技术的快速发展,为烟

10、草蛋白质组学研究奠定了坚实的基础9。近年来科研工作者对烟草进行了大量研究,作为一种新兴手段,蛋白质组学技术在烟草研究中取得了丰硕的成果。本文对蛋白质组学在烟草中的应用相关研究进展进行了综述。1蛋白质提取、分离方法研究蛋白质组学是随着蛋白质研究技术的快速发展而发展起来的。蛋白质分离技术是蛋白质组学研究的三大核心技术之一10,其中最常用的分离技术是蛋白质双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE,而蛋白质的提取和样品制备对双向电泳的分辨率和重复性起着举足轻重的作用11-13。目前蛋白质的提取方法很多,但由于不同植物具有特异的生理生化特性,蛋白质的最适提取方法

11、差异较大,甚至同一植物不同组织(器官的最适提取方法也不尽相同。采用恰当的提取方法是获得具有良好分离效果2-DE图谱的前提条件14。因此探索烟草不同组织(器官的高质量蛋白质提取分离技术具有迫切的现实意义。烟草根系既是水分和养分吸收的主要器官,又是烟碱等重要次生代谢物质合成的主要场所,与烟株发育和烟叶产量、品质密切相关。研究烟草特殊生长环境下或某个发育时期根系蛋白质的表达情况,对于及时了解烟草生长发育过程中某些代谢途径具有重要意义。然而烟草根系中蛋白质含量相对较低,并且含有大量的多糖、多酚、蛋白酶、氧化酶、酯类、醛类和其它次生代谢物质,为根系蛋白质的提取增加了一定的难度。林世锋等以栽培烟草品种K3

12、26生长期根系为材料,对常规裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol 抽提法和酚法等4种总蛋白的提取方法进行了比较15,并通过后续的2-DE对蛋白质分离效果进行了检测。研究结果表明,Trizol抽提法和酚法能够有效地抑制蛋白酶活性,防止蛋白降解和高分子量蛋白缺失,其中酚法虽然过程复杂,操作步骤繁琐,但是该提取方法得到的2-DE图谱中的分离蛋白数量较多,杂质较少,凝胶图像条带清晰,分离效果较好,更适合后续分析。烟草是叶用作物,烟叶的产量和品质是广大烟农追求的终极目标。烟叶蛋白质提取和分离方法的确立为产量和品质相关研究奠定了基础。王绍美等16以干旱敏感型烟草品种中烟100和易感黑胫病烟草品种小黄

13、金1025为试材,参照Damerval等的方法17-19,研究了旺长后期和苗期烟草叶片蛋白质样品的制备方法,并参照Huang20和Laemmli21等的方法对第一向等电聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳条件进行了优化。结果表明,采用TCA-丙酮沉淀法提取旺长后期烟草叶片蛋白质样品,提取之前进行两次丙酮预冷,选用pH 4-7 的17 cm IPG 预制胶条,上样170 L(总上样量1 mg,可以得到重复性较好,蛋白质点清晰的双向电泳图谱;苗期烟草叶片总蛋白质样品通过蛋白质分级提取、酚抽提及丙酮洗涤相结合的方法获得,选用pH 4-7 的24 cm线性IPG 胶条,水化12 h上样,上样450 L(总蛋

14、白量1.5 mg,可得到背景干净,蛋白质点清晰的双向电泳图谱。蛋白质的提取和分离技术是进行后续蛋白质组学相关研究的前提和基础,提取和分离效果直接影响最终的研究结果。得到烟草各组织(器官的蛋白质提取方法,建立蛋白质组研究适用的双向电泳实验体系并获得清晰的双向电泳图谱,可以为进一步开展烟草根系、叶片等组织(器官的蛋白质组学研究提供有力的技术支撑。2烟草胁迫蛋白质组学研究烟草在生长发育过程中会受到各种生物和非生物胁迫,如干旱、洪涝、盐碱、高温、低温、病虫草害、机械损伤等等,这些逆境条件会对烟草的正常生长发育产生不利影响,进而导致烟叶产量降低,品质下降。蛋白质是基因功能的最终执行者,是细胞增殖、分化、

15、衰老和凋亡等所有生命活动的直接体现者,它具有表达时间、表达量的差异,而且对外界的环境刺激可以能动地产生反应,逆境条件下烟草蛋白质的种类和表达量发生显著改变,形成各种内在调控机制,以适应或者抵御环境条件的改变。研究烟草胁迫条件下的蛋白质组学,为我们更加深入地了解特定条件下烟株应对环境变化所发生的生理、病理过程的内在机理、信号应答机制以及环境胁迫和抗逆性之间的关系提供了一个有力的手段,为全面地掌握抗逆相关蛋白和基因,系统地分析胁迫造成的烟株伤害机理,充分地了解烟株应对胁迫的反应机制具有重要意义。盐胁迫是植物最严重的非生物逆境胁迫之一22,进行烟草响应盐胁迫的蛋白质组研究,鉴定盐胁迫反应蛋白并了解其

16、功能,对于通过遗传学方法改良烟草耐盐抗逆性具有重要作用。Roya Razavizadeh通过蛋白质组学的方法研究了苗期烟草叶片在盐胁迫条件下蛋白质表达谱的情况23。150mM外源NaCl处理的烟草叶片中检测到205个重复性较好的蛋白点,有18个蛋白点差异表达,这些蛋白质的功能涉及光合作用、防御功能、新陈代谢、蛋白质的折叠和运输等方面,其中上调表达的蛋白质有8个,主要是RuBisCO大亚基和RuBisCO小亚基等光合作用相关蛋白,而下调表达的10个蛋白质主要是防御和能量代谢相关蛋白,包括热休克蛋白、超氧化物歧化酶、三磷酸腺苷等,其中一个70KD基质热休克蛋白表达量显著下调。低温是限制烟株地理分布

17、和烟叶产量提高的重要环境因素24。烟株受到低温胁迫后诱导胁迫应答基因表达,合成特殊的蛋白质来响应低温,提高抗寒能力25。低温胁迫对烟株生长发育和代谢途径影响的分子机制目前尚不清楚。Jin等采用2-DE和毛细管液相色谱串联质谱(CapLC-MS/MS analysis的方法研究了烟草幼苗受到4低温伤害4h以后叶片的蛋白质表达情况26。101个蛋白点的表达存在显著差异,其中22个蛋白点只在处理叶片中表达,50个蛋白点只在对照叶片中表达,处理叶片中下调表达的蛋白点有21个,上调表达的蛋白点8个。质谱鉴定出73个差异表达的蛋白质,按功能分为两大类,一类是调控类蛋白质,主要与信号转导、核酸的加工、翻译、

18、蛋白质的加工等过程相关,另一类是胁迫类蛋白质,主要与氧化还原反应、光合作用、光呼吸、碳氮代谢和能量代谢相关。与调控过程相关的蛋白质差异表达表明烟草响应低温以后存在一系列复杂的调控机制。叶片受到低温伤害以后,光合作用相关蛋白质的表达量明显降低,说明低温伤害以后,烟草叶片的光合系统和叶绿体细胞器受到了严重损害,这是低温对烟叶造成伤害的主要原因之一,也很好地解释了为什么烟草对低温伤害敏感。另外,植物受到低温胁迫以后,活性氧作为低温的信号分子大量产生,这些活性氧会导致正常细胞产生氧化损伤,植物体内存在活性氧清除系统,将活性氧维持在正常水平。Jin的研究中得到了过氧化氢酶、硫氧还蛋白过氧化物酶等活性氧清

19、除系统相关酶类的上调表达,解释了低温导致烟草发生氧化损伤的调控机制。烟草生长发育过程中会发生多种病虫草害,目前对烟草自身抗病机理的研究主要集中在抗病基因定位和分子标记辅助育种27-29、基因组学30-32和抗性基因的转化33-35等方面,针对蛋白质水平上烟草抗病机理进行的研究较少。烟草生长过程中可能发生的毁灭性病害-青枯菌的致病机理是当前植物病理学研究的重要课题之一36。宋浩等通过非标记定量蛋白质组学的方法,对烟草青枯病的致病性以及病菌侵染烟草后诱导机体的蛋白质应答进行了系统性研究37。利用蛋白质组学鸟枪法技术,在致病菌株和非致病菌株中分别鉴定出1346和1628个蛋白质,对这些差异表达蛋白质

20、水平进行评估,得到了它们在功能学上的分类信息,为进一步研究青枯病侵染烟草的生物学和病理学机制提供了一个新的研究思路。崔宏伟等研究了烟草受野火病菌侵染后蛋白质表达变化的情况,在蛋白质水平上分析了烟草抗野火病机制38。其研究共检测到10个差异蛋白质,其中6个下调表达,4个上调表达。下调表达的蛋白质主要参与叶片光合作用,他认为烟株受到病菌侵染后,物质和能量代谢相关蛋白表达量下降,光合作用降低;糖代谢相关蛋白表达量增加,加速了碳循环,从而提高了烟株抗病能力;氨基酸代谢相关蛋白表达量也增加,产生更多的氨基酸来修复被病原菌破坏的蛋白质,提高烟株抗病性。紫外线辐射对烟草来讲不仅仅是一种胁迫因子,还是香气风格

21、形成的重要调控因子39,因此紫外线辐射强度的变化会对烟叶品质产生一定的影响。陈宗瑜等利用蛋白质组学的方法,以云南普栽烤烟品种K326为试材,深入研究了低纬高原种植条件下不同紫外线辐射对烤烟生理代谢和调控途径的影响40。紫外线照射会产生活性氧,对细胞造成氧化胁迫,烟株防御机制最重要的一条途径是抗氧化酶的大量表达来清除活性氧,抵御活性氧的毒害作用,维持体内平衡,减少伤害。另外,烟株为了修复紫外线照射造成的叶片损伤,提高富含甘氨酸的RNA结合蛋白表达水平,加速信号传导过程,降低伤害程度。氮素对烟株生长发育和烟叶品质形成发挥着举足轻重的作用,氮素营养一直是烤烟栽培研究中的热点问题。施肥时间、施氮水平和

22、氮素形态等均会造成烟叶中蛋白质表达和调控的差异,进而影响烟碱合成等重要代谢过程。梁景霞以翠碧一号烟草为试材,采用比较蛋白质组学的方法对低氮与高氮两种供氮水平下的烟草根系蛋白、叶片蛋白进行了系统分析41,在蛋白质水平上较为准确和直观地了解了烟草根系、叶片在低氮胁迫下蛋白质表达的种类及丰度变化。研究结果共鉴定出21个差异表达蛋白质,涉及蛋白质代谢和降解、碳代谢、抗性与环境互作、光合反应、信号转导等不同的功能组群,从而在蛋白表达水平上更深入地解析了烟草对低氮环境的多代谢途径响应机制。目前关于植物响应机械损伤蛋白质组学的分析报道较少。烤烟生产上通过打顶,去除顶端生长优势,不仅影响根尖烟碱合成等重要代谢

23、途径,对烟叶也会产生多方面的调节和影响。杨惠娟等应用2-DE对打顶前后叶片蛋白质表达的差异变化进行了研究42,经过进一步的质谱鉴定和生物信息学分析,鉴定出了9个蛋白质在打顶前后10天的叶片中差异表达。其中上调表达的蛋白有4个,主要是光合作用中的光反应相关蛋白,即叶绿体放氧复合蛋白、Atfkbp13、PsbP 家族蛋白,另外一个与植物抗病性相关(-1, 3-葡聚糖酶前体蛋白,下调表达的蛋白质分别是SHM1、SHM2、乙醇酸氧化酶、叶绿体核糖体蛋白L1和60S 核糖体蛋白,主要涉及光呼吸和烟株的生长发育、细胞分裂等方面。这些蛋白质表达的差异表明,烟株打顶可以在蛋白质水平上增强烟草叶片的光合作用,提

24、高叶片的抗性,同时降低叶片的能量代谢,调节烟叶生长。3烟叶品质相关蛋白质组学研究烟叶品质好坏不仅直接影响烟草产品的质量和效益,而且对烟草经济的发展起着举足轻重的作用。国内外科研工作者通过分子生物学的方法对烟叶的香气风格以及烟碱等有害物质的代谢调控进行了大量研究。目前有关蛋白质组学在这方面的研究并不多见。烟叶的致香物质是烟叶内在品质的根本内容之一,烟叶的香气风格很大程度上受生态环境因素影响。不同产区具有不同风格特色烟,其蛋白质表达存在很大差异。以往对香气风格形成机理的研究主要集中在常规化学成分和致香物质等方面43-44,崔红等对浓香型特色烟(河南和清香型特色烟(福建叶片蛋白质表达水平进行了比较分

25、析,首次在蛋白质组学角度探讨了不同香气风格烟叶的形成机理45。结果发现在福建烟区高表达的蛋白质主要参与叶绿体发育、色素代谢和光合作用等过程,而与糖代谢相关的蛋白质在河南烟区高表达。说明福建烟区的特殊生态环境导致叶绿体蛋白质的合成和运转更加活跃,色素合成增加,有利于烟草进行光合作用;而河南烟区烟草的碳水化合物分解代谢比较旺盛,烟株具有较强的呼吸作用。蔡永占利用比较蛋白质组学的方法,对云南省的昆明市和丽江市两个不同气候环境的生态试验点团棵期烤烟品种云烟87的叶片蛋白质表达情况进行了研究46,鉴定出33个差异表达的蛋白质,防御/抗胁迫、蛋白质合成,矿质代谢相关的差异蛋白在昆明点的烟草叶片中表达较高,

26、增强光合效率相关的蛋白质在丽江点的烟草叶片中表达较高。该结果与昆明点平均降水量显著低于丽江点的气候特点一致,说明昆明点的烟草为了适应干旱的环境条件,合成较多的防御/抗胁迫相关蛋白来调适各种代谢途径,加强矿质代谢,维持烟株的正常生长发育。该研究结果在蛋白质表达水平揭示了团棵期烟草对不同气候环境响应的分子机理。烟碱是烟草根系合成的重要次生代谢物质,其含量高低是评价烟叶品质的重要指标之一,如何在不影响烟叶产量、品质和烟农利益的前提下降低中上部烟叶烟碱含量是烟草行业迫切需要解决的问题。烟碱的合成和积累过程存在一个异常复杂的网络调控体系,有关烟碱合成和调控的研究一直是次生代谢研究领域的焦点之一。烟草科研

27、工作者对烟碱生物合成的分子调控进行了大量研究47-48,但是关于其蛋白质网络机制的研究鲜有报道。为了深入了解打顶对烟碱合成的影响,Liu等通过2-DE对打顶前后烤烟根尖差异表达的蛋白质进行了分析鉴定50,得到4个与烟碱代谢相关的差异蛋白质,其中氨甲酰磷酸转移酶、精胺/亚精胺合成酶和内含子成熟酶(mature enzyme K表达量上调, 6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH表达量下调。烟碱的生物合成和氮素代谢密切相关,而氨甲酰磷酸转移酶催化氨甲酰磷酸的形成,该过程不但为核苷酸的合成提供氨基,同时为氨基酸的生物合成提供氨基,在氮素代谢过程中起着非常重要的作用。精胺/亚精胺对烟碱代谢具有正调控作用,其

28、含量增加有利于烟碱的生物合成。内含子成熟酶与翻译水平上的基因表达直接相关,打顶以后,内含子成熟酶通过影响碳氮代谢相关酶基因表达水平的变化,进而促进烟碱的生物合成。总体来讲,打顶导致烟株原始库源关系发生改变51,上述差异蛋白质表达水平的变化,均促进氮代谢向烟碱合成的方向进行。王茂等为了探索打顶对烟碱合成的影响以及茉莉酸信号途径在烟碱合成过程中的作用,通过茉莉酸处理模拟烟草打顶,采用差异蛋白质组学技术对烤烟根尖组织细胞蛋白质组进行了分析52。结果表明,打顶和茉莉酸处理后,S6PDH表达量下调,可能导致其调控产物蔗糖-6-磷酸(S6P含量降低,S6P对蔗糖磷酸合成酶(SPS的抑制作用降低,从而导致烟

29、株根系蔗糖产生量增加,这不仅为烟碱合成提供碳骨架和能量,还有可能促进烟碱合成相关基因的表达。3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH表达量下调,表明会有大量3-磷酸甘油醛积累,用于烟碱的生物合成。同打顶处理的结果一致,茉莉酸处理后氨甲酰磷酸转移酶和精胺/亚精胺合成酶表达量上调,它们在氮代谢过程中发挥重要作用。普通烟草叶片表面着生大量毛状体,这些毛状体对烟叶品质有重要影响53,它们分泌大量次生代谢物质,与烟叶化学成分、香吃味和抗虫性关系密切54-58。目前人们对烟叶表面毛状体的代谢途径了解较少,van Cutsem等为了研究它们在提高烟叶品质及增强抗性方面的作用,通过冰冻研磨获得了绒毛状烟草叶表毛状体,

30、然后利用2-DE结合MALDI-TOF-MS-MS二级质谱(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和高效液相色谱串联二级质谱两种方法分别获得了1373和858个蛋白点59。经过进一步研究,鉴定出这些蛋白质的功能主要涉及次生代谢、(非生物胁迫反应和初生代谢三个方面。次生代谢相关蛋白质主要是与萜类代谢有关的酶类,这也是van Cutsem 鉴定出的最主要的一类蛋白质。异戊烯基二磷酸和烯丙基二磷酸通过甲羟戊酸(MV A途径形成倍半萜和三萜,通过类萜合成代谢(MEP途径形成单萜和二萜。MEP途径所需要的七个酶在van Cutsem的研究中全部被鉴定出,催化该反应最后一步的1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-

31、磷酸还原酶是表达量最高的蛋白质之一,从而很好地解释了烟草毛状体含有丰富的类异戊二烯前体物质;鉴定出的萜类代谢相关蛋白质还包括异戊烯基焦磷酸异构酶、牛儿基二磷酸合酶和环化酶等。鉴定得到的非生物胁迫反应相关蛋白质主要包括植物解毒相关酶类,如谷胱甘肽转移酶,它将细胞内毒性分子与谷胱甘肽结合,然后将结合产物送入液泡,在异生物质的脱毒过程发挥作用,同时它还在植物对病原入侵的超敏反应过程中发挥作用,病原入侵后植物体爆发大量H2O2等活性氧来抵御病原菌的侵害,H2O2会诱导谷胱甘肽转移酶的表达,以此来保护细胞内DNA和脂肪免受氧化胁迫的损伤;非生物胁迫反应相关蛋白质还包括超氧化物歧化酶、过氧化物还原酶、硫氧

32、还蛋白过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶等,它们在抗坏血酸-谷胱甘肽循环等活性氧清除过程中发挥作用,保护细胞免受活性氧的伤害;生物胁迫反应相关蛋白质主要包括几丁质酶和葡聚糖酶等,说明毛状体作为烟叶的“第一线”,的确在防御系统中发挥着重要作用;van Cutsem的研究还鉴定得到了最近在烟草上刚刚发现的一个新的蛋白质phylloplanins,它可以抑制孢子萌发,在感病早期防止病原菌入侵。该研究鉴定出的初生代谢相关蛋白质中,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和果糖-1,6-二磷酸酶这两种酶主要存在于糖异生途径中,可能为蔗糖酯的合成提供碳水化合物;类酯代谢相关蛋白质与蜡质的形成有关;氨基酸代谢相关酶类主要参与S-

33、腺苷蛋氨酸循环和支链氨基酸的代谢过程。4小结随着越来越多的生物全基因组测序工作的完成,蛋白质组学技术得到了突飞猛进的发展,为进一步揭示生物体生长发育及响应外界环境因子的关键代谢途径的分子机制提供了蛋白质组水平的证据,更加贴近了人们对生命现象和生命活动本质的认识。烟草科研工作者利用该技术,在烟株不同组织(器官发生的特殊生理生化变化的内在机制以及抵御胁迫反应的分子基础等方面取得了丰硕的研究成果,具备广阔的发展前景。但仍存在不足之处,主要表现在:首先,蛋白质组学研究中,蛋白质的分离主要通过2-DE来实现,但是2-DE存在某些技术性的挑战,比如蛋白样品制备效率偏低,特别是疏水性膜蛋白提取比较困难,一些

34、低丰度蛋白在制备过程中可能会丢失,多种可能具有重要功能的痕量调控蛋白很难分离;强碱性等蛋白质的分离存在一定困难,选用窄范围的胶条水合上样容易产生背景横纹,影响进一步检测结果的准确性。尤其对于烟草来讲,由于其特殊的生物学特性,导致烟草根系中蛋白质含量相对较低,同时富含多糖、多酚以及多种酶类、酯类、醛类和其它次108 中国烟草学报2014 年 2 月 第 20 卷 第 1 期 genitaliumJ. Electrophoresis, l995, l6(1: 1090-1094. Cánovas F M, Dumas-Gaudot E, Recorbet G, et al. Plant

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42、. 生代谢物质，因而根系蛋白质的提取相对比较困难。 第二，烟草蛋白质组学主要侧重的是对组织 ( 器 官 生长发育过程和响应胁迫的蛋白质表达特征的研 究，对蛋白质功能、蛋白质翻译后修饰和蛋白质互作 等方面的研究较少；由于低丰度和膜蛋白的分离鉴定 比较困难，对亚细胞蛋白质组学的研究较少，叶绿体 等作为烟草叶片最重要的细胞器，其在代谢活动等生 命过程中的意义尚未充分揭示。 第三，目前烟草蛋白质组学的检测技术一般都是 质谱等非定量检测，对于定量研究烟草组织 ( 器官 蛋白质表达的正调控或负调控报道较少。 针对上述问题，笔者认为下一步烟草蛋白质组学 研究工作应该重点在以下几个方面进行： 烟株内蛋白质间密

43、切互作，通过复杂的信息传 递形成网络体系，影响烟株生长发育和代谢过程。将 烟草蛋白质组学技术与转录组学、代谢组学、生理组 学和代谢调控网络有机结合，使烟株的生理表现与基 因、转录、蛋白、代谢等层面上的分析相结合，将更 有利于发挥蛋白质组学技术在生命现象研究中的枢纽 作用，进一步明确基因调控与蛋白质表达的关系，明 确烟碱等次生代谢物质的合成途径、烟株抗逆的深层 机理，为相关理论研究和育种工作作出更大贡献。 加强对蛋白质功能方面的研究，运用功能基因组 学、生化反应等手段进一步证实新蛋白质在烟株生长 发育过程中以及特殊环境条件下的功能。比如在基因 组学充分发展的基础上，进一步探索未知功能的蛋白 结构

44、，深入研究结构与功能的相关性，探索蛋白的未 知功能，揭示目标蛋白在信号转导途径中的地位及作 用机理；把 DNA 微阵列与蛋白质组学分析相结合， 进一步确定基因调控是在转录水平进行还是在翻译水 平或者蛋白质积累水平进行， 更深入地研究基因功能 ； 加强对烟草亚细胞 ( 细胞器 蛋白质组进行研究，建 立相应的蛋白质组数据库，有利于进一步研究蛋白质 的差异表达、功能、定位和翻译后的修饰，有助于迅 速确定优良表现型的性状基因，推进品种改良，加快 烟草育种步伐。 在充分利用现有方法和技术的基础上，烟草蛋白 质组学的发展， 将会在进一步揭示基因组功能和结构， 阐明烟草生长发育、代谢调控和进化规律等各生命活

45、 动机理方面取得重大突破。 参考文献 1 Wasinger V C, Cordwell S J, Cerpa-Poljak A, et al. Progress with gene-product mapping of the mollicutes: Mycoplasma 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 赵凤霞等蛋白质组学技术在烟草研究中的应用进展 19 Cui Suxia, Huang Fang, Wang Jie, et al. A proteomic analysis of cold stress responses in rice

46、seedlingsJ. Proteomics, 2005, 5(12: 3162-3172. Huang Fang, Parmryd I, Nilsson F, et al. Proteomics of Synechocystis sp. strain PCC 6803: identication of plasma membrane proteinsJ. Mol Cell Proteomics, 2002, 1(12: 956-966. Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head o

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