双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

1、双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法ISSN 100727626 中国生物化学与分子生物学报 2005 年 10 月 CN 23870?11 Q Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 215 :691,694 技术与方法? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 1 2 2 3 2 2 3 3 翁 瑜 曾 群力姜 槐 许正平 1 浙江大学生命科学学院 2 浙江大学医学院 浙江省生 物电磁学重点研究实验室 3 浙江大学医学院环境基因组学研究中心 杭州 310031 摘要 组织 或细胞 的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电

2、泳 22DE 的分辨率 . 为探索建 立适用于人乳腺癌细胞株 MCF27 蛋白质提取的最 佳条件 比较目前在双向凝胶电泳中常用的 3 种 蛋白质提取方法对 MCF27 细胞 总蛋白的提取效率 MCF27 细胞经培养后分别采用 M2PER 试剂、标准裂解 液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质 然后进行双向凝胶电泳 并根据凝胶上蛋白质 斑点的丰 度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量 以确定 MCF27 细胞蛋白质 提取的相对最佳方法结果显示 M2PER 试剂法得到的图谱分辨率较低蛋白质 主要集中分布在分子量 15,70 kD pH 417, 613的范围内 标准裂解液法得到的谱分辨率有所提高蛋白质分布

3、比 M2PER 试剂法得到的图谱广硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的 尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效 果比前两者好 . 结果表明 在 3 种常用的蛋白质提取方法中 硫脲裂解液对细胞蛋 白质的溶解性最佳 相对更适合于提取 MCF27 细胞的蛋白质 并与双向凝胶电泳条 件更兼容 . 关键词 蛋白质提取 双向凝胶电泳 MCF27 条件优化 中图分类号Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Two2 DimensionalElectrophoresis 2 3 3 ZENG Qun2Li J IANG Huai XU

4、Zheng2Ping 1 2 2 3 2 WENG Yu 1College of Life Sciences 2 Bioelectromagnetics Laboratory 3 Research Center forEnvironmental Genomics Zhejiang University School of Medicine Hangzhou310031 China Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achievehigh2resolution protein separation

5、in two dimensional electrophoresis 22DE . Threeroutine cellular total protein extraction methods were compared 2 in order to determine anoptimal one for human breast cancer cell line MCF 7. The cultured MCF27 cells werelysed by M2PER kit standard lysis buffer or improved lysis buffer respectively. T

6、hen theextracted total proteins were subjected to 22DE and the best extraction method wasdetermined by the indexes of protein distribution and abundance on correspondingsilver2stained gel . Data showed that use of M2PER kit gave the lowest resolution in whichmost proteins were distributed in the p I

7、 ranging from 417 to 613 withmolecular weight between 15 kD and 70 kD. Standard lysis buffer improved proteinresolution with broader protein distribution pattern. Improved lysis buffer generated thebest resolution among these three methods especially for the high2abundance and highmolecular weight p

8、roteins. Based on above results we concluded that the improved lysisbuffer has the best protein solubilization ability which renders it much more suitable forcellular protein extraction from MCF27 and is more compatible with the conditions of 22DE.Key words protein extraction two dimensional electro

9、phoresis MCF27 optimization 收稿日期 : 2004212203 接 收日期 :2005203221 国家自然科学基金项目 No. 50137030 30170792 浙江省自然科学基金项目 No. 301524 和 浙江省卫生厅重点项目 No. 2004ZD006 资助 3 联系人 :0571287217386 Fax :0571287217410 E2mail : zpxu zju. edu. cn TelReceived : December 3 2004 Accepted :March 21 2005Supported by National Natural

10、Science Foundation of China No. 5013703030170792 and Natural Science Foundation of Zhejiang Province No.301524 andKey Program of Health Bureau of Zhejiang Province No.2004ZD0063Corresponding author Tel : 0571287217386 Fax : 0571287217410 E2mail : zpxu . cn 692 中国生物化学与分子生物学报 21 卷 双向凝胶电泳 two2di

11、mensionalelectrophoresis 22细胞 培 养 箱 是 Forma 公 司 产 品 分 光 光度 计 DE 是蛋白质组学研究中分离蛋白质的主要技术之 双向电泳设备 SmartSpecTM3000 spectrophotometer 、 1 一 其原理是根据蛋白质等电点的不 同在 pH 梯一向是PROTEAN IEF cell 二向是 PROTEAN Plus 度胶内进行第一向 等电聚焦分离 然后根据蛋白质 Dodeca Cell 和 GS2800 扫描仪是 Bio2Rad 公司 的产的相对分子量大小利用聚丙烯酰胺凝胶进行第二向 品 超声波细胞粉碎仪购自 宁波新芝科器研究所

12、低分离 经染色后得到二维的蛋白质分布图谱 . 双向凝 温高 速离心机和混合器由 Eppendorf 公司生产 . 胶电泳高分辨率分离蛋白质的关键是 组织或细胞样 112 细胞培养 品的制备 即蛋白质的提取 . 蛋白质提取一般使用含 MCF27 细胞接种于含 10 胎牛血清的 DMEM 表面活性剂和还原剂等成分的裂解液 其变性剂 、 新鲜培养基中 37 ? 常规培养于含 5 湿润 CO2 的中 变性剂如尿素使 蛋白质变性并使蛋白质水解酶 细胞培养箱里 . 待单细胞层近汇合时 胰酶消化 并 失活表面活性剂如 CHAPS 促进蛋白质溶解还原 4 2 以 3 X 细胞？的密度接种 于直径为 100 m

13、m 的 10 cm 剂如 DTT 使蛋白质内的二硫键处于还原状态 有利 3 个细胞培养皿 ORANGE US 冲.24 h 换液后 继于蛋白质的溶解.然而 目前的 蛋白质样品制备方法 续培养 24 h 提取蛋白质 此时每皿细胞数为 1 X 10 7 存 在着一些缺陷 : ? 获得的样品中往往含有干扰物 个 . 质 如盐离子 、 、 核酸 脂 类和多糖等 从而引起蛋白质 113 蛋白质提取电泳行为的变化 其后果是不仅在一 向电泳中干扰 M2PER 试剂法：弃去皿中的旧培养基 用预冷蛋白质的等电聚焦 而 且会影响二向中蛋白质的迁 的 PBS 洗细胞 2 次加入M2PER 试剂 500 卩每 10

14、7 l 2 移 . ? 由于蛋白质溶解性的不同 约占细胞蛋白总 细胞 在冰上静置裂解 5 min 后 迅速用刮棒刮下量 30 的膜蛋白在常用裂解液中很难溶解 导致二 细胞 并 收集到 115 ml 离心管中 . 4 ? 、 000 g 离心 12 3常用裂 8 min 后 取上清储存于 - 向图谱上出现的主要是可溶性蛋白质 . ?70 ? 备用 . 解液抽提方法步骤多 、耗时长 容易引起蛋白质丢失 标准裂解 法：离心收集胰酶消化的细胞后 用预和降解 . 因此 为适应不同组织或细胞的特殊理化性 7 冷的 PBS 洗细胞 2 次然后每 1 X 细胞加 1 ml 裂 10 质需要针 对不同来源的样品

15、进行蛋白质提取条件解液 8 mol?尿素 4 CHAPS 现加 65 mmol?DTT L L 的优化 以获得足够量、高纯度的蛋白质样品用于后和 012 W?Bio2Lyte pH 3,10 放于冰上静置 V 续实验.裂解 30 min 再超声 180,200 W 每 次工作 10 s间 本实验以人乳腺癌细胞株 MCF27 为对象 比较 隔 10 s 共 20 次 最后以 4 ?20 000 r? 离心 1 h min 了 3 种不同的蛋白质提取方法包括 Pierce 公司的哺 取上清储存于-70 ? 备用.乳动物蛋白抽提试剂 M2PER、标准裂解液 和添加硫硫脲裂解法：离心收集到的细胞经预冷

16、的 PBS 脲的裂解液对 22DE 结 果的影响了解不同裂解液的 7 洗 2 次后在 1 X 10 个细胞中加含硫脲裂解液 7 提取效率以及它们与双向凝胶电泳条件的兼容性mol?尿素2 mol?硫脲 4 CHAPS现加 65 mmol? L L 从而建立了 MCF27 细胞总蛋白的相对最佳提 取 L DTT 和 012 W?Bio2Lyte pH 3 , 10 约 1 ml . V 方法后续步骤同标准裂解法 114 蛋白质定量 1材料与方法 参考文献 4采 用 Bradford 法定量 以牛血清白 111 材料 蛋白为标准蛋白.人乳 腺 癌 细 胞 株 MCF27 购 自 ATCC 公司 11

17、5 双向凝胶电泳 Number : HTB222 取含 250 卩 蛋白质的上述蛋白质提取液 用上 g胎牛 血清和 改良型 Eagle 培养基 Dulbecco n s 样水 化 缓冲液 7 mol? 尿素 2 mol? 硫脲 4 L Lmodified Eagle n s medium DMEM 购自 Hyclone 公司 CHAPS 65 mmol? DTT 012W?Bio2Lyte pH 3, L V 胰酶为 Invitrogen公司固相 pH 梯度胶条、二硫 1001001 溴酚蓝 补充体积到 300 卩后将 17 cm、l CHAPS、苏糖醇9dithiothreitol DTT

18、、丙烯酰胺、甲叉 pH 4,7 的固相 pH 梯度线性胶条 覆盖于该蛋白溶双丙烯酰胺和尿素等购自Bio2Rad 公司 M2PER 试液上方被动水化 12 h 然后进行等电聚焦 17 ?剂为 Pierce 公司产品 硫脲购自 Sigma 公司 牛血清 250 V 30 min 1000 V 3 h 10 000 V 5 h 10 000 V产品 . 60 000 Vh . 聚焦结束后 分别用含 2 DTT 和 215 第 5 期 翁 瑜等 : 双 向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 693 碘乙 酰 胺 的 胶 条 平 衡 缓 冲 液 6 mol? 尿 素2 L 后两种方法好 .SDS 013

19、75 mol? Tris2Cl pH 818 20甘油 平衡胶条 L 212 双向凝胶电泳所检测蛋白质的数量各 15 min. DTT 是 为了还原蛋白质的二硫键 而碘乙 利用 PDQuest 软件自动统计 22DE 图谱上的蛋 酰胺是为了去除多余的 DTT. 平衡完毕后 将胶条紧 白质斑点数量 . 蛋白质斑点 选定标准是 : 斑点个体独贴在 12 的聚丙烯酰胺凝荷戏 ? 进行第二向电泳 立 形 态明显 3 次实验重复出现 . 结果显示 :M2PER 恒压 200 V 615 , 7 h .电泳结白蛋白为生物工程公司束后采用改进的银 试剂法胶上蛋白点平均有 1350 ? 个 标准裂解法 12

20、染方法对 凝胶进行染色 然后用 Bio2Rad 的 GS2800 4 胶上蛋白点平均为 1326 ? 个 硫脲 裂解法胶上的 10扫描仪扫描图像 所获图象用 PDQuest 711 分析软件 蛋白点平 均为 1368 ? 个 . 以上结果说明 3 种提取 9 进行分析 . 实验重复 3 次 . 方法 对蛋白质的检出数量影响不大 . 213双向凝胶电泳图谱上蛋白质的分布 2 结果 FigllA 显示 M2PER 试剂法得到的双向电泳图211 蛋白质定量 谱横纹多而明显 高丰度的蛋白点区域分辨率偏低 M2PER 试剂法提取的总蛋白浓度为 41018 椭圆 1 区域 高分子量蛋白点 方框 2 区域 分离 mg?体积为 015 ml总蛋 白量为 21009 mg 标准裂 ml 效果较差 独立蛋白点少 . 但在分子量为 15,70 kD 、解法提取的总蛋白浓度为 31762 mg? 体积为 1 ml pH417,613 的范围内 方 框 3 所示M2PER 试剂法 ml 总蛋白量为 31762 mg 硫脲裂解法提取的总蛋白 提