S-SOP-QC-200-02 微生物限度检查法操作规程

1、 标准操作规程（SOP）题目：微生物限度检查法标准操作规程页数第 1 页 共6页编号：S-SOP-QC-200-02制定人：制定日期：原编号：S-SOP-QC-200-01审核人：审核日期：制定部门：质量管理部审核人：审核日期：批准人：批准日期：生效日期：有效期至：分发部门：QC室1、目的：规定微生物限度检查法操作规程。2、适用范围：适用于QC室检验员进行微生物限度检查时使用。3、职责：质量管理部对此规程负责并不断完善之，QC室检验员经培训后执行该操作规程。4、内容：4.1 设备4.1.1 无菌室4.1.1.1 结构和要求：无菌室要采光良好，避免潮湿，远离厕所及污染区（面积不超过10平方米，高

2、度不超过2.4m）由缓冲间（2个），操作间组成。操作间与缓冲间之间有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不直对，无菌室内六面光滑平整，能耐受清洗消毒，墙与地面及墙壁、天花板连接处呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不安装下水道。无菌室内的照明灯嵌装在天花板内。室内照明要分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均设置紫外线杀菌灯（2W/m32.5W/m3），紫外线杀菌灯距实验台面高度不超过1m，并定期检查辐射强度，不得低于40W/cm2（1m距离）。不符合要求的紫外杀菌灯及时更换。4.1.1.2 温度、湿度：参照QC室温湿度管理规程（S-SMP-QC-026）。操作间或净化工作台的洁净空

3、气应保持对环境形成正压，不低于5Pa。4.1.1.3 操作间：操作间安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不低于10000级，局部净化度为100级（或放置同等级净化工作台），并备有药物天平、镊子、乙醇灯、火柴、乙醇棉、大小橡皮乳头等。4.1.1.4 缓冲间：缓冲间内要有白大挂、无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不放置培养箱和其他杂物。4.1.1.5 消毒处理：在每次操作前、后均用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，然后开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。4.1.2 阳性菌试验应另设单独的净化台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。编号： S-SOP-

4、QC-200-02题目：微生物限度检查法标准操作规程第 2 页 共6页4.1.3 其他设备：恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2328）、适宜的加热装置，振荡器、匀浆仪（3000r/min8000r/min）、恒温水浴、热干燥箱（200300）、电冰箱、离心机、离心管、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要定期进行生物指示剂灭灭菌效果检查并定期请有关部门检定）。4.2 仪器及器皿4.2.1 0.45m滤膜及薄膜过滤器、菌落计数器、显微镜（1500x）、电子天平或药物天平（感应0.1g）、pH系列比色计。4.2.2 玻璃器皿 锥形瓶（250ml300ml，内装玻璃珠若干；500ml，1000ml）、研

5、钵（陶瓷制，直径10cm12cm）、培养皿（9cm）、量筒（100ml，500ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20或30ml）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于180干热灭菌2h或高压蒸汽121灭菌30min，烘干备用。4.3 用具4.3.1 大、小橡皮乳头

6、（放于干净带盖的容器中，并定期用70%75%乙醇溶液浸泡）。4.3.2 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌、备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。4.3.3 接种环（白铱金镍铬使合金，环径4mm5mm、长度6cm10cm）乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、陶瓷盖（12cm）、0.45m滤膜、实验记录纸等。4.4 试液4.4.1 消毒液4.4.1.1 0.1%苯扎溴铵或其他适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。4.4.1.2 5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用），亦可选用其

7、他适宜消毒液。4.4.1.3 75%乙醇溶液4.4.1.4 碘酊或碘伏溶液4.4.2 稀释剂和试剂4.4.2.1 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。4.4.2.2 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121灭菌30分钟。编号： S-SOP-QC-200-02题目：微生物限度检查法标准操作规程第 3 页 共6页4.4.2.3 无菌聚山梨酯-80氯化钠溶液：取1ml聚山梨山酯-80，加0.9%氯化钠溶液使成100ml，121灭菌30分钟。4

8、.4.2.4 无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）：取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，120灭菌30分钟。4.4.2.5 无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解使成100ml，121灭菌30分钟。4.5 培养基4.5.1 配制的培养基没有沉淀，如有沉淀，要于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.5.2 培养基的分装量不超过容器的2/3。以免灭菌时溢出。包装时，塞子要塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.5.3 培养基配制后在2h内灭菌，避免繁殖。4.5.4 灭菌后的培养基应在225保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。4.5.5

9、 不能用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份受热而破坏。而用水浴或微波炉加热。已熔化并开启后的培养基应一次用完，剩余的不宜再用。4.6 供试品抽样、保存及检查量4.6.1 抽样4.6.1.1 一般采用随机抽样方法，抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的35倍量（以备复试）。4.6.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。4.6.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，直接判为不合格，无需再抽样检验。4.6.2 保存4.6.2.1 供试品在检验之前，保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试

10、品内污染菌因保存不妥引起致死亡，损伤或繁殖。4.6.2.2 供试品在检验之前，保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不作为供试品。4.6.3 检验量4.6.3.1 所有剂型的检验量均取2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，需取自4丸、4片以上）。4.6.3.2 固体半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。4.6.3.3 液体制剂检验量为10ml.4.6.3.4 膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为25cm2，化学药及生物化药膜剂检验量50cm2。4.6.3.5 特殊贵重或微量包装的药品，检验量酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g；液体制剂采用原液者不少于6ml，采用供试液不少于3ml；外

11、用药品不少于5g。编号： S-SOP-QC-200-02题目：微生物限度检查法标准操作规程第 4 页 共6页4.7 操作方法4.7.1 试验前准备4.7.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆瓶、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂移至无菌室内，每次试验所用物品事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后，将全部外包装（牛皮纸）去掉。4.7.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。4.7.1.3 操作者用洗手液洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换作工作鞋，再用0.1%苯扎溴铵溶液或其它消毒洗液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、

12、手套。4.7.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇球）擦拭供试品瓶、盆、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪刀将供试品启封。4.7.2 供试液的制备4.7.2.1 液体供试品 取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀，作为1：10供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液直接作为供试液。4.7.2.2 固体、半固体或粘稠供试品 称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，用匀浆仪（3000r/min5000r/min，2min4min）或其他有效的方法，混匀，作为供

13、试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯-80，并置水浴适当加温使供试品分散均匀。4.7.2.3 非水溶性供试品 油剂：取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯-80（5ml8ml）使供试品分散，再加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml。4.7.2.4 肠溶胶囊（片）供试品： 称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内。于45水浴中，保温、振摇、使溶解，作为供试液。4.7.2.5 含抑菌成分供试品： 当供试品具的抑菌活性时，应消除供试品的抑菌活性后，再依法检查。常用方法有：4.7.2.5.1 稀释法：将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度

14、。4.7.2.5.2 离心沉淀集菌法：取规定量的供试液，离心（3000转/min）20分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml ，再稀释成原规定量。如有不溶性药渣，可先离心（500转/min）3分钟，取全部上清液，再行集菌处理。4.7.2.5.3 薄膜过滤法：取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45m微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜数次，每次50ml100ml，取出滤膜备检。4.7.2.5.4 中和法：凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。编号： S-SOP-QC-200

15、-02题目：微生物限度检查法标准操作规程第 5 页 共6页4.7.3 供试液的稀释（10倍递增稀释法）4.7.3.1 取23个均含90ml灭菌稀释剂的灭菌三角瓶，另取1支10ml灭菌刻度管吸1：10供试液10ml，加入上述灭菌三角瓶中混匀，（此时勿在乙醇灯焰峰上正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）即为1：100供试液，以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：100、1：1000等适宜稀释级（至少共2级）。每递增1稀释级，另换一个含90ml灭菌稀释剂的灭菌三角瓶及吸管 。4.7.3.2 在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸约10次。吸液时，应先吸至高于

16、吸管上部刻度，再沿下一级稀释瓶的内壁靠近液面（勿接触液面）流出全部供试液，然后将吸管放入消毒液缸内。4.7.4 检查法4.7.4.1 平皿法：每一稀释级注23个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液。注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌阴性对照，另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。4.7.4.2 薄膜过滤法： 取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0的无菌氯化钠-

17、蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。4.7.5 倾注培养基：将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌，酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜，王浆液体制剂另加用YPD琼脂）熔化，冷至约45时倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。4.7.6 培养：细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于2025培养箱中培养5天。4.7.7 数方法的验证：当建立药品的微生物限

18、度检查法、或药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，应进行计数方法的验证。4.7.7.1 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所定的方法对各试验菌的回收率逐一进行验证。4.7.7.2 试验菌的浓度为50cfu/ml100cfu/ml4.7.7.3 验证方法：验证试验至少进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌的回收率。编号：S-SOP-QC-200-02题目：微生物限度检查法标准操作规程第 6 页 共6页4.7.7.3.1 试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50cfu/ml100cfu试验菌，分别注入平皿，立即倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备2个

19、平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50cfu/ml100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。4.7.7.3.2 菌液组测定所加的试验菌数4.7.7.3.3 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。4.7.7.3.4 稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心、或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，用相应的稀释液代替供试品，加入试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数法测定其菌落数。4.7.7.3.5 结果判断 在

20、3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集法、薄膜过滤法、中和法等方法处理以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。5、附录：S-SOR-SOP-QC-200-0104 微生物限度检查原始记录6、参考文献：国家药典委员会-中国药品检验标准操作规范-2010年版。7、培训对象：QC副主任、QC工程师、QC室检验员。8、培训时间：20分钟。9、培训老师：QC主任。10、文件修订历史生效日期版本号修订控制号修订内容

21、摘要2013.05.1300无新建文件2014.03.3101QM-0028增加微生物限度观察记录（S-SOR-SOP-QC-200-05）02OZ-0002质量负责人变更 *微生物限度检查原始记录S-SOR-SOP-QC-200-01-02品名检验编号批号规格供样单位数量送检日期年 月 日检验日期年 月 日检验依据 温度：湿度：【检查】微生物限度 照微生物限度检查法标准操作规程（S-SOP-QC-200）检查。供试液的制备：常规法：供试品 ， 。非水溶性供试品：供试品 ， 。 其它： 方法描述：平皿法：吸取供试液 ml，培养。 培养基稀释法：吸取供试液 ml，等量分注到 个平皿，培养。 薄膜

22、过滤法：取供试液 ml，置于pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 ml中，混匀，过滤， 再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 ml，分 次冲洗，每次冲 ml，培养。备注：细菌总数（方法： ）霉菌及酵母菌总数（方法： ）培养箱（型号： 编号： ） 3035 培养箱（型号： 编号： ） 2328 培养时间： 月 日 时 分至 月 日 时 分培养时间： 月 日 时 分至 月 日 时 分培养基：营养琼脂 批号：培养基：玫瑰红钠琼脂 批号：平皿号原液10-110-210-3阴性环境平皿号原液10-110-210-3阴性环境1122平均数平均数结果 cfu/ （应cfu/ ）结果 cfu/ （应cfu/

23、）大肠埃希菌（方法： ）沙门菌培养箱（型号： 编号： ） 3035 培养箱（型号： 编号： ） 3035 方法：取上述供试液 ，至 ml的胆盐乳糖培养基中，摇匀，培养 小时，取0.2ml，至5mlMUG培养基中。方法：取供试品10g，至 ml的营养肉汤培养基中，摇匀，培养 小时，取1ml，至10ml四硫酸钠亮绿培养基中，摇匀，培养 小时。供试品阴性对照阳性对照供试品阴性对照阳性对照MUG胆盐硫乳琼脂靛基质麦康凯琼脂EMB平板（MacC）三糖铁琼脂革兰氏染色、镜检判定说明：无菌生长的用“”表示，有菌生长或菌 落形态特征相符或疑似用“”表示。判定说明：无菌生长的用“”表示，有菌生长且菌 落形态特征

24、相符或疑似用“”表示。结果： （应不得检出）结果： （应不得检出）结论：本项目按 检验，结果 规定。备注：“”：选用，“×”：不选用，“/”：不需填写。 复核员/日期： 检验员/日期： S-SOR-SOP-QC-200-02-00品名检验编号批号规格供样单位数量送检日期年 月 日检验日期年 月 日检验依据 温度：湿度：【检查】微生物限度 照微生物限度检查法标准操作规程（S-SOP-QC-200）检查。大肠菌群供试液的制备：取本品10g，加45pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀后，作为1：10的供试液；吸取1：10的供试液1ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至

25、10ml，作为1：100的供试液；吸取1：100的供试液1ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml，作为1：1000的供试液。方法描述：取含10ml的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml、1：100的供试液1ml、1：1000的供试液1ml，另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养箱（型号： 编号： ） 3035 培养时间： 月 日 时至 月 日 时培养基供试液供试液阳性对照阴性对照10-110-210-310-110-210-3乳糖胆盐发酵管EMB或MacC平板乳糖发酵管判定说明：无菌生长或有菌生长但不产酸产气或菌落形态特征不符的用“”表示，产酸产气或菌落形态特征相符或疑似用“”表示。结果： 未检出