分子标记在兰花遗传育种中的研究进展

1、分子标记在兰花遗传育种中的研究进展黄有凯1,2,陈程1,汪天1,张水明1*(1安徽农业大学园艺学院,安徽合肥230036;2合肥一中,安徽合肥230036摘要综述了RFLP 、RAPD 、SCAR 、ISSR 、SRAP 、AFLP 、SSR 等分子标记的基本原理和主要特点,从遗传多样性分析、亲缘关系研究、种质资源鉴定、遗传图谱构建与辅助选择育种等方面介绍了分子标记在兰花遗传育种工作中的现状及其研究进展,并提出展望。关键词分子标记;兰花;遗传育种中图分类号S188文献标识码A 文章编号05176611(2012120699605Research Advances in the Applicat

2、ion of Molecular Markers in the Genetic Breeding of Orchid HUANG You-kai et al (College of Forestry and Landscape ,Anhui Agricultural University ,Heifei ,Anhui 230036Abstract This paper reviews the basic principle and main characteristics of several molecular markers ,including RFLP ,RAPD ,SCAR ,IS-

3、SR ,SRAP ,AFLP and SSR ,then introduced the research status and advances of these molecular markers in the genetic breeding of orchids from genetic diversity ,genetic relationship ,germplasm resources appraisal ,construction of genetic map and assisted selection breeding ,and finally forecasted the

4、future of molecular markers researchKey words Molecular markers ;Orchids ;Genetic breeding基金项目安徽省自然科学基金项目(11040606M95。作者简介黄有凯(1970,男,安徽宣城人,硕士,中教一级,从事生物物理研究,E-mail :huangyoukaisohucom 。*通讯作者,副教授,博士,硕士生导师,从事园林植物与观赏园艺研究,E-mail :zhangshuimingahaueducn 。收稿日期2012-01-17分子标记技术是一种新型的遗传标记,它以DNA 分子的多态性为基础,是反映生

5、物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA 片段,是分子水平上遗传变异的直接反映。20世纪80年代以来,该技术得到了飞速的发展,现已有数10种标记技术,与传统的遗传标记相比,其优越性体现在:直接以DNA 形式表现,在植物体的各个组织、不同发育时期均可检测到,不受季节、环境条件限制,不存在表达与否的问题;数量极多,遍及整个基因组;多态性高,自然存在着许多等位变异,不需专门创造特殊的遗传材料;表现为“中性”,即不影响目标性状的表达,与不良性状无必然的连锁;有许多分子标记表现为共显性,能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型,提供完整的遗传信息1。由于其有众多优点,近年来已广泛应用于园艺植物分子育种研究2。

6、兰花(Orchid 是整个兰科植物(Orchidaceae 的总称,它是有花植物中科最大的植物种类之一,全世界约有800多属,25000多种,分布于世界各地,大多数种类分布于东南亚、澳大利亚、中南美洲、非洲和马达加斯加。我国野生兰花资源丰富,约有173属1200多种以及大量的变种,在南北各地均有分布,但以云南、台湾、海南最为丰富3。由于兰科植物变异大,中间类型多,种的界限不清楚,且目前主要的育种方法仍是传统的驯化育种,导致我国兰花品种选育进展缓慢,不能满足日益增长的市场需求4。利用兰花分子标记技术进行遗传育种,将有助于对我国兰花种质资源的分类鉴定。研究其遗传多样性,可揭示品种间的亲缘关系,为分

7、子标记在兰花遗传育种上的应用奠定基础。该研究综述了几种分子标记的基本原理、主要特点以及其在兰花遗传育种中的研究进展。1主要的分子标记种类和基本原理11以分子杂交为核心的标记技术限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP RFLP 的概念于1980年由人类遗传学家Botstein 等首次提出5,是最早应用的分子标技术。其基本原理是基因组DNA在限制性内切酶作用下,由于不同物种中酶切位点的差别,或是酶切位点上的核苷酸的变化,产生大小不等的DNA 片段,用特异DNA 探针进行Southern 杂交,通过放射显影来揭示DNA 的多

8、态性。该标记呈孟德尔式共显性遗传,结果稳定可靠,重复性好。目前其主要应用于遗传图谱构建、基因定位及遗传多态性分析,但该标记对DNA 的要求较高,涉及探针标记和分子杂交等,操作繁琐,技术复杂;多态性较少;成本高;有放射性;其多态性依赖于内切酶的使用。这些在很大程度上影响了该标记在育种领域的推广应用。12以PCR 技术为核心的标记技术1985年,美国PE-Ce-tus 公司的Mullis 等发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR ,该技术的出现使得体外扩增DNA 片段成为可能。由于PCR 具有检测快速、对模板DNA 需要量小等特点,基于该技术的分子标记技

9、术相继出现。121随机扩增多态性(Random Amplified PolymorphicDNA ,RAPD 标记。RAPD 标记是1990年由Williams 和Welsh 同时提出67,其基本原理是以一个随机的寡核苷酸序列为引物(通常为10bp ,通过PCR 扩增基因组DNA ,产生不连续的DNA 产物,经电泳分离后检测扩增产物的多态性。该技术操作简单;模板DNA 用量少(15 25ng ;无放射性。目前RAPD 标记已广泛用于种质资源鉴定与分类、目的基因的标记等研究中。其缺点是标记多为显性标记,不能鉴别杂合子和纯合子;试验稳定性差。122序列特异性扩增区域(Sequence Charac

10、terized Ampli-fied Region ,SCAR 标记。SCAR 标记是由Paran 和Michel-more 在RAPD 标记基础上提出的8。其基本原理是先对特异RAPD 等片段进行回收、克隆和测序,再依据其两端的特异序列设计特异引物进行PCR 扩增。该标记为共显性遗责任编辑王春艳责任校对卢瑶安徽农业科学,Journal of Anhui AgriSci2012,40(12:69967000传;稳定性和可重复性高。目前已被广泛用于辅助选择育种、抗病基因连锁定位、构建QTL、种质鉴定和种子纯度检验等方面。123ISSR标记。简单重复序列间扩增由Zietkiewicz等于1994年

11、提出9。该技术检测的是2个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性,其基本原理是利用真核生物基因组中广泛存在的SSR设计引物,对基因组DNA进行多位点PCR 扩增。该标记为显性标记,具有无需预知基因组序列、DNA 样品用量少、多态性丰富、操作简单、试验稳定性较高等特点,已被运用于种质收集、品种鉴定、遗传多样性分析、遗传作图、基因定位、标记辅助选择等研究中。124相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism,SRAP标记。2001年Li和Quiros正式提出SRAP为新一代分子标记10。它是针对基因外显子里GC含量丰富而启动子和内含子里AT含量

12、丰富的特点来设计引物对ORFs(Open Reading Frames进行扩增,SRAP引物包括一个17个碱基的正向引物(F-primer和一个18个碱基的反向引物(R-primer;扩增结果因不同个体的内含子、启动子以及间隔区长度不等而产生多态性11。该标记具有简便、稳定、中等产率、便于克隆目标片段等特点。目前,SRAP已用于植物的遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因定位、比较基因组学等领域。125扩增片段长度多态性(Amplified Fragments Length Polymorphism,AFLP标记。AFLP是1992年由Zabeau和Vos 发明的一项DNA指纹技术12。其基本原理

13、是选择性扩增基因组DNA的酶切片段。技术流程是先对基因组DNA进行酶切,所得酶切片段上连接双链人工接头作为模板,再通过接头序列和PCR引物3'端选择性碱基序列的识别,进行选择性PCR扩增。由于不同材料的DNA酶切片段长度存在差异而产生了扩增产物的多态性,最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA片段多态性。AFLP技术实质上是RFLP和PCR 两项技术的结合13。该标记为共显性或显性,稳定性强,重复性好;结果可靠;多态性丰富。AFLP标记技术已经在生物遗传连锁图谱构建、指纹图谱绘制与品种鉴定、遗传多样性分析及基因定位等方面得到了广泛应用。但该标记对DNA 纯度和内切酶的质量要求较高;涉及酶切和

14、连接,步骤繁琐,对技术要求相对较高。126简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR标记。SSR也称微卫星(MicrosatelliteDNA14,由人类遗传学家Litt 等建立的一种新型分子标记技术15。它是以1 4个碱基为重复单元的简单重复序列,如(GAn,(ACn,(GAAn等。SSR在真核生物基因组DNA中分布广泛,其基本原理是根据SSR两端保守序列设计一对特异性引物来扩增SSR片段,由于基因组中SSR重复长度和次数的不同而引起扩增产物的大小差异,最后经电泳检测多态性。SSR为共显性标记,采用PCR检测时DNA样品用量少,且对DNA的质量要求不高,同时,该标记

15、还具有数量丰富、多态性高、试验程序简单、特异性强、重复性好,易于用PCR检测等优点。目前主要用于资源鉴定、遗传多样性分析、连锁图的绘制、基因定位、DNA指纹图的绘制、标记辅助育种等方面。缺点是必须依赖测序设计引物。然而近年来,随着公共数据库的发展,大量的SSR引物序列已经可以直接在公共数据库中查找到,因此SSR分子标记的应用越来越广泛。13新型的分子标记技术131单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs标记。Lander于1996第一次正式提出SNPs为新一代分子标记16。SNPs是由染色体基因组水平上单个核苷酸的变异(替换、插入、缺失等引起的

16、基因序列多态性。该标记的开发首先需要对全基因组测序(公用数据库的发展,节省了测序的工作,然后根据测序结果确定特定的序列标记位点,对STS(sequence taged site进行扫描寻找SNPs位点,最后确定SNPs,将其定位到染色体上。SNPs标记分布广泛,在人类基因组中大约1000bp中出现一次17,其具有多态信息量大;稳定性高;易于快速、高通量地进行基因型分析;检测速度快;为功能型分子标记等特点。随着关联分析方法和芯片技术的发展,奠定了该标记在种质资源的DNA指纹分析、品种鉴定、分子标记辅助选择、遗传图谱构建、关联分析及其在解析不同作物复杂数量性状遗传网络等方面的应用。132表达序列标

17、签(Expressed Sequence Tags,ESTs标记。ESTs是指通过对cDNA文库中随机克隆进行测序所得的cDNA5'或3'端序列,一般长度为150 500bp18。自从Ad-ams等19首次提出EST概念后,EST技术取得了飞速发展, 1991年各个公共数据库中的EST数目不足2000条。1993年,美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotech-nology Information,NCBI建立了一个专门的EST数据库dbEST(data base of EST来收集和保存所有的EST数据。到2011年11月1日,NCBI中的d

18、bEST数据库已收集2323种物种的ESTs,共71235293条。EST标记依据其开发的方法不同可分为5类:EST-SSR 标记;EST-PCR标记;EST-SNP标记;EST-AFLP标记;EST-RFLP标记。以EST为基础的分子标记具有信息量高,易于开发和通用性好等特点20。由于EST标记表现出的巨大潜力,目前已在遗传图谱的构建、基因定位、生物群体多态性研究等工作中广泛运用。综上所述,各种分子标记技术都有其自身的优缺点。随着生物信息学、基因芯片等新技术的快速发展以及各种分子标记技术相互结合使用,必将不断地开发出分析速度更快、信息量更大、成本更低的分子标记用于植物遗传育种领域。2分子标记

19、技术在兰花遗传育种中的研究进展21遗传多样性分析物种的遗传多样性是长期进化的产物,也是种质资源创新和品种改良的物质基础。利用分子标记技术对种或品种间DNA水平上的多态性信息进行统计分析,可从分子水平提供遗传变异的证据,较为全面地掌握现有种质资源的遗传多样性。国内外对兰花遗传多样性的研究也开展了很多工作。799640卷12期黄有凯等分子标记在兰花遗传育种中的研究进展谢伟等21用RAPD技术对兰属7个种的9个品种进行遗传多样性和亲缘关系分析。从60个随机引物中筛选出6个引物,检测到64个位点,其中多态位点61个(953%。聚类分析结果表明,不同兰花品种之间存在明显的遗传差异。胡薇等22应用RAPD

20、标记对建兰38个品种的遗传多样性和亲缘关系进行分析。用筛选的18个10bp随机引物对其DNA进行PCR扩增,共扩增出116个位点,其中多态位点103个(8879%,表明建兰38个品种具有丰富的遗传多样性。甘娜等23利用RAPD标记系统评价了大花蕙兰20个品种的遗传多样性。在50个RAPD引物分析中,有36个(72.0%引物能揭示材料间的多态性。根据遗传相似系数进行聚类分析表明,RAPD标记能将所有材料区分开。赵谦等24采用ISSR分子标记技术对14个蝴蝶兰品种进行品种间遗传关系的研究。筛选出的14个引物共扩增出179条带,其中多态性条带147条(82%。吴振兴等25将ISSR技术应用于16种兰

21、属的遗传多样性分析,15个引物共扩增出836条带,其中有227条多态带(272%。UPGMA 聚类结果显示:春兰与春剑的亲缘关系最近,而兔耳兰与其他15种兰属植物的距离最远。Lu FB等26用SRAP标记分析蝴蝶兰“Frigdaas Oxford”自交后代的遗传多样性。蝴蝶兰“Frigdaas Oxford”花朵黄色,带有红紫色斑点,自交后代个体在数量、大小及斑点分布上均有很大的差异。用SRAP标记分析后代中的159个个体,从594个供试的SRAP引物组合中共筛选出14个多态性引物组合,扩增出80条多态性条带。经UPGMA树状图谱显示,159个个体可被分成12簇。Cai XY等27用SRAP标

22、记分析了中国濒危兰花“Dendrobium loddigesii Rolfe”的遗传多样性和种群结构。利用SRAP标记来评估Dloddigesi的7个种群的遗传多样性水平和模式,17个SRAP的引物组合共扩增出231条清晰的带,其中187条(80.95%为多态性条带。在物种水平上检测出的遗传多样性的高水平是多态性为80.52%。UPGMA聚类将种群分为2大簇。朱根发等28对来源于日本、韩国和美国的42个大花蕙兰品种和2个国产兰属原生种进行了遗传多样性和亲缘关系的AFLP分析,9对多态性引物共扩增出1597条带,其中多态性带1565条(980%,表明大花蕙兰品种间的遗传多样性丰富。Duffy K

23、J等29用AFLP标记和4个质体SSR标记检测来自爱尔兰的兰花Palbida的种内和种间遗传差异,并且把该兰花品种的SSR数据与Pstraminea做比较。AFLP 结果分析显示Palbida有高度的多态性;在种内和种间有显著差异,这种差异伴随着距离上的种群遗传隔离而增加。SSR标记分析显示无种内、种间差异,但所有的爱尔兰个体与Pstraminea有相同的等位基因。因而,要评价Palbida/ Pstraminea的分类地位,需要进一步的研究。22分类与亲缘关系研究研究兰花的分类及亲缘关系对育种有着重要的指导意义。在育种上,通常选择亲缘关系较远的材料,以增加后代的遗传变异,从而选育出杂交优势强

24、、综合性状好的优良品种。分子标记所代表的是基因组DNA 水平上的差异,因而利用分子标记研究兰花的分类及亲缘关系具有结果客观、稳定的优点。孙彩云等30利用RAPD分子标记分析中国兰属(Cym-bidium的28个原生种,3个变种,16个品种及3个杂交种共50个材料间的亲缘关系,获得250条可明显区分的DNA扩增片段。UPGMA进行聚类分析显示,RAPD的聚类树状图所呈现出的亲缘关系大体与ITS系统发育树一致。建兰亚属可能为一个自然类群。大花亚属并非自然类群,其成员之一文山红柱兰偏离出去而与兰亚属聚在一起。兰亚属则为一个高度异质性的类群,分散成互不关联的3支。李冬梅等31利用RAPD分子标记对10

25、个墨兰叶艺品种进行亲缘关系分析。从100个随机引物中筛选出17个多态性高的引物,共扩增出159条DNA带。UPGMA聚类分析结果表明,墨兰叶艺品种间的亲缘关系与形态学分类结果基本一致,且与品种来源地密切相关。李冬梅等32利用RAPD标记方法对来自日本、韩国、中国和美国的48个大花蕙兰品种和2个国产兰属原生种的种质资源亲缘关系进行了检测。从100个10bp随机引物中筛选出20个多态性高的引物,共扩增出258条DNA带。UPGMA聚类分析将50份种质划分为5大类群。供试50份种质间的遗传亲缘关系与其来源地、花色、花枝类型和杂交系谱有一定的相关性。Shen TsaiMu等33利用RAPD和ISSR分

26、析了11个台湾当地登入的蝴蝶兰和17个菲律宾蝴蝶兰的遗传差异和内部关系。结果从200个RAPD引物和100个ISSR引物中分别筛选到12和3个引物,获得了95个RAPD标记和50个ISSR 标记,根据所得的RAPD和ISSR数据进行聚类分析,可把它们分为6组。吴振兴等34利用RMAPD技术对兰属16种植物进行了亲缘关系研究,所得结论与Du PuyCribb分类系统基本一致,表明该标记能在分子水平上对传统兰属分类进行补充。李敏等35利用ISSR技术分析16个蝴蝶兰品种的亲缘关系,筛选出的8个引物共扩增出193条片段。聚类分析结果表明,来源于不同地域的16个品种在遗传距离L=02225处可分为2个

27、类群;来源于日本、台湾的品种聚类为一簇,新育成的品种为一簇。严华等36以5种国兰的38个品种为试验材料,进行了ISSR分子标记分析。从100条随机引物中筛选出10条引物,共扩增出89条DNA片段。利用UPMGA 法对遗传相似系数进行分析并构建系统树,聚类结果与传统分类基本一致。张俊祥等37采用AFLP技术对云南兰属的14个种和3个变种的38个样本进行亲缘关系分析,在相似系数058的水平下,将38个样本分成3组。23种质资源鉴定种质资源是遗传育种和品种改良的基本材料。近10年来,随着兰花育种新方法新技术的不断出现,育种进程明显加快,品种急剧增加,这就对品种鉴定提出了更高的要求。用传统的植物鉴别方

28、法来对一些疑难种、易混种进行鉴别,往往很难得出正确有效的结论。而分子标记技术以其稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变8996安徽农业科学2012年异及试验结果的可靠性等优点为品种鉴定提供了新手段。季祥彪等38采用272个RAPD标记,对贵州12种兰属植物进行研究。结果表明,引物S13,S26及S139扩增的谱带多、清晰、多态性明显,它们单独及结合使用,能有效地将所有供试种类区分开来。蹇黎等39应用ERAPD(延长随机引物扩增对21个中国兰花品种进行分子鉴定。结果表明, RAPD分析中共有8个(10%引物和88条(8381%多态性带纹;ERAPD分析中能获得1条25kb RAPD特异性片

29、段。Yung WS等40将基于ITS(internal transcribed spacer序列开发的SCAR标记用于蝴蝶兰濒危物种Parmeniacum、Pmicranthum、Pdelenatii及其杂种的鉴定。由于这3个物种和它们的杂种很难从形态学上区分开来,故利用rDNA-ITS序列设计物种专一性的SCAR标记对其进行鉴定。结果显示在Parmeniacum上开发出的标记有效的扩增出的DNA产物大小为600bp,在Pmicranthum上扩增出的为700bp,在Pdelenatii上扩增出的为300bp。通过将开发出的3种SCAR 标记用于PCR扩增试验,进一步证实了物种专一性标记的有效

30、性。赵谦等24采用ISSR分子标记技术对14个蝴蝶兰品种进行品种间遗传关系的研究。筛选出的14个引物组合可区分该14个品种,并且检测到20条品种特异性条带,这些品种特异条带可用于鉴定供试蝴蝶兰中的10个品种。UPGMA 聚类分析表明,14个品种可聚为2类。陈惠云等41利用AFLP分子标记技术对18种名贵春兰品种进行了DNA指纹图谱分析,筛选出的16对引物在18个名贵春兰品种中共扩增出345条带,其中有多态性带169条(4899%;通过这些多态性条带的不同组合,对供试春兰品种的区分率为100%。24遗传图谱构建遗传图谱既是遗传研究的重要内容,又是种质资源分析、遗传育种及分子克隆等许多应用研究的理

31、论依据和基础。近年来,分子标记的迅速发展大大促进了遗传连锁图的构建和应用。各种分子标记技术的出现使各种植物的遗传图谱越来越完整,在建立起完整的高密度的分子图谱后,可将其有效地应用于质量、数量性状的基因定位、图位克隆基因、比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中,加速植物育种进程。兰花遗传图谱的构建工作已经开展,谢伟等42利用随机扩增多态DNA技术(RAPD对兰属的3个品种春兰、春剑、蕙兰进行了分析研究,建立了它们之间的DNA指纹图谱,找到了参试样品的特征谱带,并探讨了它们之间的亲缘关系。结果从20条BA系列引物中筛选出能稳定扩增的10个引物,对3个品种的植株进行扩增,共扩增出257条,其中2

32、43条具有多态性,结果分析表明春剑与春兰的相似系数高于其与蕙兰的相似系数。黄少玲43利用RAPD标记构建了一张包含9个连锁群、由121个标记位点组成的春石斛分子遗传图谱,图谱总长度65687cm,标记间平均距离为5011 cm,连锁群长度变动在1288 10430cm之间。标记最多的连锁群有21个标记,最少的有3个。谭文澄等44采用LZF-1寡核苷酸探针和限制性内切酶Hinf1,检测兰属23个样株和石斛属1个样株的DNA酶解片段,获得了由6 15条带组成的清晰的特异性遗传指纹图谱。25辅助选择育种分子标记辅助选择育种(Molecular Marker Assisted Selection,MA

33、S是利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记对个体进行优势基因型的筛选。作为辅助育种的分子标记可以通过连锁标记对目的性状进行早期间接选择,对某些不期望性状能及时发现和淘汰,减少回交育种时的连锁累赘,大大缩短育种周期,实现多个重要性状和基因的累加,这是在常规育种中不可能实现的。王健等45采用BA系列的100条随机引物,对16种有香和无香春兰进行RAPD分析,结果显示其中引物BA0088 (G08对香花春兰的扩增产物中具有一条370bp的特异性条带,带型清晰,重复性较好,这为进一步确定与香味成分相关基因连锁的RAPD标记打下了基础。3展望分子标记已经被广泛应用于遗传育种中。随着分子生物学的进一步发展,

34、分子标记技术在兰花育种领域的运用将更加广泛和深入,该技术准确、可靠和高效率的优点也在实践中充分表现出来。在与传统育种技术相结合的基础上,利用和开发更为高效的分子标记方法(例如EST-SSR标记成为兰花分子标记育种研究的重点之一。应用分子标记技术从遗传多样性分析、分类与亲缘关系研究、种质资源的分子鉴定、遗传图谱构建、辅助选择育种等各个方面对兰花品种进行深入广泛的研究,可为兰花新种发现与名品鉴赏、育种和杂交亲本的选择提供丰富的分子水平上的依据。各种分子标记技术相互渗透使用及其与特异基因的分离克隆和转基因等技术的相结合,将为兰花育种工作奠定技术基础。参考文献1贾继增分子标记种质资源鉴定和分子标记育种

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44、netic diversity analysis of Phalaenop-sisFrigdaas Oxfordusing SRAP markers with reference to those genes responsible for variations in the pigmentation of petals and sepalsJJournal of Horticultural ScienceBiotechnology,2011,86(5:48649227CAI X Y,FENG Z Y,ZHANG X X,et alGenetic diversity and populatio

45、nstructure of an endangered Orchid(Dendrobium loddigesii RolfefromChina revealed by SRAP markersJCientia Horticulturae,2011,129(4:87788128朱根发,李冬梅,郭振飞大花蕙兰遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析J园艺学报,2007,34(2:41742429DUFFY K J,FAY M F,SMITH R J,et alPopulation genetics and conser-vation of the small white orchid,pseudorch

46、is albida,in irlandJBiology and Environment Proceedings of the Royal Irish Academy,2011,111(2: 738130孙彩云,张明永,叶秀粦,等中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的RAPD分析J园艺学报,2005,32(6:1121112431李冬梅,朱根发,叶庆生墨兰“达摩”芽变叶艺品种亲缘关系的RAPD分析J热带作物学报,2007,28(3:747732李冬梅,叶庆生,主根发大花蕙兰种质资源亲缘关系的RAPD分析J中国农业科学,2007,40(4:80080633ZHUANG H T,SHEN Z M,YAN

47、 Y F,et alPhylogenetic analysis of fivePhalaenopsisspecies native to Taiwan or the Philippines by using RAPD and ISSR molecular markersJJournal of the Chinese Society for Horti-cultral Science,2004,50(2:17518534吴振兴,施农农,赵艳应用RMAPD分子标记技术研究兰属植物间的亲缘关系(简报J分子细胞生物学报,2008,41(2:14514935李敏,王尧峰,明凤用ISSR分子标记技术分析1

48、6个蝴蝶兰品种的亲缘关系研究J中国农业科技导报,2010,12(1:606536严华,张冬梅,罗玉兰,等38种国兰亲缘关系的ISSR分析J分子植物育种,2010,8(4:73674137张俊祥,李枝林,范成明,等云南野生兰属主要种间亲缘关系的AFLP分析J园艺学报,2006,33(5:1141114438季祥彪,王国鼎,康继川,等贵州12种兰属植物资源形态学和RAPD标记的比较分析J种子,2008,27(2:565939蹇黎,武海,张以忠,等21个兰花品种的延长RAPD(ERAPD和PCR-RFLP分析J中国农学通报,2010,26(14:23223740YUNG W S,YU J L,YIN

49、 S H,et alDevelopment of ITS sequence basedSCAR markers for discrimination of Paphiopedilum armeniacum,Paphio-pedilum micranthum,Paphiopedilum delenatii and their hybridsJSci-entia Horticulturae,2011,127:40541041陈惠云,张志栋,孙日飞,等AFLP分子标记技术在名贵春兰鉴别中的应用J中国农学通报,2007,23(2:707342谢伟,乐超银,郭政宏兰花基因组DNA多态性RAPD分析J湖北

50、农业科学,2006,45(1:242643黄少玲春石斛兰品种的倍性鉴定及RAPD分子遗传图谱的构建D武汉:华中农业大学,2007:363744谭文澄,方盛国,谢海,等兰属植物DNA指纹图的研究J四川师范大学学报:自然科学版,1999,23(4:40741145王健,乐超银,谢伟,等兰花香味相关基因的RAPD分子标记J江苏农业科学,2006(5:檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪7879(上接第6992页18AHSAN N,LEE D G,LEE S H,et alExcess copper induced physiologicala

51、nd proteomic changes in germinating rice seedsJChemosphere,2007, 67(6:1182119319肖清铁,戎红,周丽英,等水稻叶片对镉胁迫响应的蛋白质差异表达J应用生态学报,2011,22(4:1013101920汤华,向福英,柳晓磊,等植物铝离子胁迫的研究方法综述J武汉植物学研究,2007,25(5:49449921YANG Q,WANG Y,ZHANG J,et alIdentification of aluminum-respon-sive proteins in rice roots by a proteomic appro

52、ach:cysteine synthase as a key player in Al responseJProteomics,2007,7(5:73774922AHSAN N,RENAUT J,KOMATSU SRecent developments in the appli-cation of proteomics to the analysis of plant responses to heavy metals JProteomics,2009,9(10:2602262123LEE D G,AHSAN N,LEE S H,et alA proteomic approach in analyzingheat-responsive proteins in rice leavesJProteomics,2007,7(18:3369338324H