乙肝疫苗接种无、弱应答与遗传因素关系

1、乙肝疫苗接种无、弱应答与遗传因素关系乙肝疫苗接种无、弱应答与遗传因素关系第四军医大学学报2000年第21卷第1期刘蓬勃徐慧文王学良李辉庄贵华乌正赉张孔来摘要：目的从现场流行病学和实验研究两方面探讨乙肝疫苗接种无、弱应答是否与遗传因素有关.方法健康小学生634名接种3针血源性乙肝疫苗,共筛选出29名无、弱应答者,同时选择30名强应答者作为对照.对无、弱应答者和强应答者一级亲属(同胞和父母)中符合疫苗接种条件的对象接种3针乙肝疫苗,观察免疫反应.另外，从无、弱应答和强应答者中选择部分对象检测人类白细胞抗原（HLA）-A,B,C,DR,DQ座位等位基因.结果小学生无、弱应答率为4.6%(29/634

2、).无、弱应答者和强应答者一级亲属接种3针乙肝疫苗后,无、弱应答发生率分别为25.0%和10.0%.无、弱应答者HLA-DR7和B54频率分别为52.2%和21.7%,明显高于强应答组9.1%和0.扩展HLA单体型频率在无、弱应答者中为17.0%,而在强应答者中为0.结论对乙肝疫苗无、弱应答与遗传因素有关.关键词：肝炎疫苗；乙肝；HLA抗原；应答0引言乙型肝炎（以下称乙肝）疫苗的免疫效果已得到国内外学者的反复证明，可是，人群接种乙肝疫苗后，约有5%10%的人不产生保护性抗体或抗体水平很低1,2，这些人称为无、弱应答者. 无、弱应答的发生与多种因素有关3,4，排除疫苗接种的一些不利因素和机体的某

3、些因素外，无、弱应答仍有发生.近几年，国外研究已发现乙肝疫苗接种无、弱应答与HLA有关，从实验研究提示无、弱应答可能与遗传因素有关，但这些研究尚缺乏现场流行病学资料的支持.本次研究拟选择强应答者作为对照，用现场流行病学研究方法并结合实验研究，从宏观和微观两方面综合探讨无、弱应答与遗传因素的关系.1对象和方法1.1对象对西安市北郊3所小学，年龄在514岁的634名小学生，按0，1，2方案(在第1针疫苗接种后的第1，2月分别接种第2，3针疫苗)接种了3针10g血源性乙肝疫苗，于第1针疫苗接种后的第6月对所有疫苗接种对象采血检测乙肝3项指标(HBsAg,抗-HBs,抗-HBc),对HBsAg和抗-H

4、Bc阴性，抗-HBs的S/N（样本每分钟放射性计数/阴性对照每分钟放射性计数）值10者于第8月再次采血复测乙肝3项指标，结果29人仍然HBsAg和抗-HBc阴性，抗-HBs的S/N值10，确定为无、弱应答者.对这29名无、弱应答者又用聚合酶链反应(PCR)方法检测HBV DNA，全为阴性，排除了无、弱应答是由于低水平病毒感染引起的可能.选择与无、弱应答者同期进行疫苗接种及随访采血、同性别、同地区、年龄相差不超过2岁、抗-HBs的S/N值50者作为强应答者对照，共30人.以上确定的29名无、弱应答者和30名强应答者所有一级亲属（父母和兄弟姐妹）作为本次研究对象.1.2方法对无、弱应答一级亲属（组

5、）和强应答者一级亲属（组），分别为80人和79人填写“乙肝疫苗接种无、弱应答者家系调查表”，内容除一般情况外，主要调查2组暴露HBV机会和乙肝疫苗接种史及乙肝病史等有关因素，同时对每例研究对象静脉抽血5 mL，分离血清后统一检测HBsAg,抗-HBs和抗-HBc 3项指标.调查和采血无一失访. 对组和组中HBsAg和抗-HBc均阴性、抗-HBs的S/N值10且无乙肝疫苗接种史者，按0，1，6方案接种3针10g血源性乙肝疫苗，接种疫苗的同时，调查可能影响2组一级亲属抗-HBs产生的有关因素，于第1针疫苗接种后的第7个月采血检测抗-HBs.按年龄由大到小的顺序，从29名无、弱应答者选23人，30名

6、强应答者选22人，检测HLA-A，B，C，DR，DQ座位等位基因.无、弱应答者和强应答者基本按11比例同时进入实验，由同一操作者采用盲法编号进行检测. hBsAg，抗-HBs和抗-HBc的检测用放射免疫法，实验方法按照厂家说明书，检测试剂由北京北方免疫试剂研究所生产. hBsAg和抗-HBs以S/N值2.1为阳性标准，抗-HBc以N/S值2.0为阳性标准. hBV DNA的检测试剂盒购自华美生物技术公司，扩增产物经电泳分析，在紫外灯下观察结果.HLA类抗原的检测采用微量细胞毒试验法5，血清板和兔补体购自卫生部北京生物制品研究所HLA实验室（A，B，C座位分别可检测15，24，7个等位基因）.具

7、体实验步骤和结果判定参照该室提供的实验方法. HLA类抗原的检测也采用微量细胞毒试验，血清干板和干燥的兔补体购自美国One lambda 公司；B细胞的分离采用磁珠分离法；DR，DQ座位分别可检测13，6个等位基因.所有对象的调查结果和实验结果均输入计算机，用dBase建立数据库并进行简单的数据整理，用Epi info软件进行分析. 率的比较用2检验或确切概率法.抗-HBs计算几何均值(GMT)，GMT的比较用t检验.2结果2.1无弱应答与遗传因素关系的现场流行病学研究表1无、弱应答和强应答组一级亲属HBsAg,抗-HBs,抗-HBc阳性率及HBV感染率比较tab 1Comparison of

8、 positive rate of HBsAg,anti-HBs,anti-HBc and HBV infection between group and groupGroupnHBsAgAnti-HBs*Anti-HBcHBVinfectionn%n%n%n%8056.32233.34455.04860.07945.12440.03443.04151.9*Rule out whom ever be vaccinated. : The first degree relatives (parents and sibling) of non- or hypo-responders； : The f

9、irst degree relatives of hyperresponders.表2无、弱应答和强应答组一级亲属HBsAg和单项抗-HBc阳性率比较tab 2Comparison of the positive rate of HBsAg and isolated anti-HBc between group and groupGroupnHBsAg(+)Isolated anti-HBc(+)Totaln%n%n%8056.32227.5b2733.8b7945.1810.11215.2b表3无、弱应答和强应答组一级亲属接种乙肝疫苗后抗-HBs s/N值及GMT的分布tab 3Distri

10、bution of anti-HBs S/N and GMT in group and group vaccinated with HB vaccineGroupnAnti-HBs level (S/N ratio)GMT2.12.1-10.0-100.0-300.0-n%n%n%n%n%28517.9b27.1725.01346.413.6b44.2a2900.0310.3620.71034.51034.5121.7aP0.05, bP0.01 vs group . SN: cpm (sample)cpm (negative control). Group,: The same as Tab

11、 1.组接种乙肝疫苗后,无应答（S/N2.1）的发生率为17.9%,明显高于组0(P0.01);无、弱应答（S/N10）率前者为25.0%(7/28),后者为10.0%(3/29);抗-HBs的GMT前者为44.2,显著低于后者121.7(P0.05) (Tab 3).2.2无、弱应答与遗传关系的实验研究无、弱应答组B54，DR7频率明显高于强应答组，而B5频率相反低于强应答组. p值经乘以分型的等位基因数校正后，无、弱应答组DR7频率仍然显著高于强应答组，而B5和B54的P值经校正后，2组不存在差别(Tab4).表4无、弱应答组和强应答组有统计学意义的HLA等位基因比较tab 4Compar

12、ison of statistically significant HLA alleles between non- or hyporesponders and hyperrespondersAllelesNon- or hypo-res-ponders (n=23)Hyperresponders(n=22)FisherPAdjustedPNo.Pos.fi*pi*No.Pos.fi*pi*B500.0000.00050.2270.1210.0200.480B5450.2170.11600.0000.0000.0500.960DR7120.5220.30920.0910.0470.0010.0

13、133讨论无、弱应答的形成机制目前尚不完全清楚，当然首要的问题必须清楚无、弱应答是否与乙肝疫苗的免疫源性和注射剂量有关. pilot等6对从前完成3针乙肝疫苗接种的无应答者又接种了3针包含前-S2和S区的重组疫苗，发现也不能避免无应答的发生. bertino等7最近报道对3针血源性乙肝疫苗无应答者再接种3针重组疫苗仅有62.5%产生保护性抗体.对无、弱应答者和先前抗体阳性但阴转者再复种3针乙肝疫苗，无论抗体滴度、持续时间及血清抗体阳转率比较，前者均明显低于后者8.因此看来，对乙肝疫苗无、弱应答确实是疫苗接种中存在的一个实际问题，目前尚无足够的证据将其完全归结于疫苗的免疫源性和注射剂量不足.其他

14、因素，包括注射部位、途径、方案、性别、年龄、超重、吸烟、免疫抑制、潜在HBV感染（血清学检查阴性但PCR诊断阳性）等都与其有关，但是，当这些因素被排除后，无、弱应答仍然发生，因此这些因素不能满意解释此现象，可能遗传因素不能被忽视. kruskall等9和Alper等1指出对乙肝疫苗的抗体反应与人类主要组织相容性复合体（MHC）有关,而且通过常染色体显性方式而遗传,而对乙肝疫苗无应答是由于免疫反应基因的缺乏且通过MHC连锁的隐性方式而遗传.这些发现与日本Hatae等10的解释不同,他报道对乙肝疫苗缺乏反应明显通过显性方式而遗传,他同时发现无应答者的MHC等位基因大部分是杂合型,因此免疫抑制基因是

15、显性表达.我们在中国人群中发现,无应答的家庭成员中无应答者存在聚集现象,28个家庭中，7个家庭有2个无、弱应答者(先证者和他的一级亲属).无、弱应答者一级亲属接种3针乙肝疫苗后无论从抗体阳性率和几何均值均显示低于强应答者一级亲属,说明无、弱应答组一级亲属对乙肝疫苗的应答能力低于强应答组一级亲属，显然无、弱应答与个体的遗传背景有关.在无、弱应答者中,DR7表型的频率为52.2%,明显高于强应答者9.1%,我们认为在中国人中,DR7等位基因可能与无、弱应答有关,同时发现大多数DR7阳性的无、弱应答者DR7等位基因都是杂合型的,可能是通过显性而不是隐性方式而遗传.我们的结论与日本学者10相一致,与美

16、国Alper1的结果不同.进一步对无、弱应答者和强应答者的单体型分析发现，无、弱应答组HLA-B54-DR7单体型频率为17.4%，而强应答组为0，大多数B54与DR7连锁在一起可能是2个等位基因连锁不平衡的结果,B54-DR7单体型可能是缺乏对HBsAg的正常免疫反应基因或者是存在免疫缺陷基因.其他单体型在2组之间没有差别.另一方面,无、弱应答者是否易成为HBsAg慢性携带者尚不清楚.我们研究发现,在感染机会相同的情况下,无、弱应答者一级亲属中有4个HBsAg慢性携带者,而在强应答者一级亲属中只有2个(P0.05),但单项抗-HBc阳性率在前者为27.5%,明显高于后者10.1%(P=0.0

17、05). 单项抗-HBc假阳性化验结果显然不能解释2组之间的差别,因为我们在另外一项研究中11作者简介：医学系流行病学教研室，陕西西安 710033)徐慧文（西安医科大学流行病学教研室，陕西 西安 710061)王学良（西安医科大学流行病学教研室，陕西 西安 710061)李辉（中国医学科学院、中国协和医科大学流行病学教研室，北京 100005)庄贵华（西安医科大学流行病学教研室，陕西 西安 710061)乌正赉（中国医学科学院、中国协和医科大学流行病学教研室，北京 100005)张孔来（中国医学科学院、中国协和医科大学流行病学教研室，北京 100005）参考文献1Alper CA. the

18、human immune response to hepatitis B surface antigen J. Exp Clin immunogenet， 1995;12(3):171-181.2徐慧文，李东升，徐经武et al.国产血源性乙肝疫苗的远期效果及保护持久性研究J.中华流行病学杂志, 1992;13(3):362-365.3Johann J, Burckhardt PB, Walter P. Antibody determination in an ongoing hepatitis B vaccination program J. J Med Virol, 1996;20(2):

19、199-206.4Struve J, Aronsson B, Frenning B et al. Intramuscular versus intradermal administration of a recombinant hepatitis B vaccine: A comparison of response rates and analysis of factors influencing the antibody response J. Scand J infect Dis, 1992;24(4):423-429.5Watanabe H, Okumura M,Hirayamn K

20、et al. HLA-Bw54-DR4-DRw53-DQw4 haplotype controls nonresponsiveness to hepatitis-B surface antigen via CD8-positive suppressor T cells J. Tissue Antigens, 1990;36(1):69-74.6Pillot J, Poynard T, Elias A et al. Weak immunogenicity of the preS2 sequence and lack of circumventing effect on the nonresponsiveness to the hepatitis B virus vaccine J. Vaccine,1995;13(3):289-294.7Bertino JS,Tirrell P,Greenberg RN et al. A comparative trial of standar