一种提取植物基因组DNA的方法_改良尿素法

1、第42卷第3期华中师范大学学报(自然科学版Vol.42No.3 收稿日期:2008203228.基金项目:国家自然科学基金项目(30450002.3E 2mail :caohhtt .文章编号:100021190(20080320448204一种提取植物基因组D NA 的方法改良尿素法曹文波13,郑璐璐1,谢文海2(1.华中师范大学生命科学学院,武汉430079;2.广西玉林师范学院,广西玉林537000摘要:介绍了一种从玉米和水稻叶片中提取高质量基因组DNA 的改良尿素法.与其他常用方法如CTAB 法、SDS 法等相比,这种改良方法具有产率高、快速省时、可常温操作、成本耗用低等优点.结果证明

2、,采用这种改良方法获得的基因组DNA 纯度高、浓度大,适合用于限制性内切酶的酶切反应、基于PCR 基础上的遗传多样性分析、基于传统的Southern 杂交的遗传图谱分析以及其他下游分子生物学研究,是一种适于植物基因组DNA 制备方法,值得推广的.并针对基因组制备过程中经常出现的难题,分析了产生的原因,提出了具体解决办法.关键词:基因组DNA 提取;改良尿素法;浓度和纯度中图分类号:Q813文献标识码:A提取高质量的基因组DNA 是分子生物学研究的基础,DNA 的纯度和完整性是保证顺利进行遗传学研究的首要条件.随着分子生物学的发展,以PCR 为基础的分子标记技术,如:随机扩增多态性(RA PD

3、、单重复序列(SSR 、简单重复序列间扩增(ISSR 、扩增片段长度多态性(A FL P 等广泛应用于遗传多样性研究领域,并推动了植物遗传学研究.利用这些技术,使同时进行多样品分析成为可能,但同时也为高效、快速制备高质量基因组DNA 提出要求.制备基因组DNA 的方法多种多样,原理大致相同,但各种方法操作过程和所需条件各不相同,也产生了效率差异.遗传多样性研究、遗传图谱分析及其他分析生物学相关的下游研究.1材料和方法1.1材料尿素裂解液成分:7mol 尿素,0.3mol/L 氯化钠,0.034mol/L 十二烷基肌氨酸钠,50mmol/L Tris (p H8.0,20mmol/L ED TA

4、 (p H8.0,2巯基乙醇(M E 约2%(加入量可根据所用材料而定,如叶片细胞中次生物质含量高,可适当加量.氯化钠和2巯基乙醇为国产试剂,其它均为Sigma 公司产品.Tris 2饱和酚、氯仿和异戊醇混合液,体积比为25241.加入约16L 2M E 和8mL 裂解缓冲液,并彻底混合均匀.第3期曹文波等:一种提取植物基因组DNA的方法改良尿素法449称取约5g叶片,放入预冷的研钵中用液氮迅速研磨,研磨充分后转入裂解液中并用玻棒混匀.加入8mL Tris2饱和酚、氯仿和异戊醇混合液(通风橱操作,充分混匀(混合动作要轻柔.室温下在水平摇床上以最大转速孵育约10min 后,以4400g(E pp

5、endorf,A24262转速离心约20min.取上清约8mL,加入0.3mL10mol N H4AC 混合均匀(裂解、离心充分的上清透明不浑浊,如上清颜色呈褐色,应适当增加2M E的量.加入2倍体积经预冷的无水乙醇,轻柔转动离心管,直到形成絮状核酸沉淀(如果核酸有褐色斑块,会影响核酸溶解,应当增加2M E的量.快速倒出乙醇再加入浓度为70%的乙醇,轻柔晃动管子数次洗涤,以去除残留的尿素和盐离子.再次用70%乙醇洗涤后转移沉淀于另一离心管,加入4mL TE缓冲液(p H8.0,于转速缓慢的摇床溶解约1030min,如果30min后核酸仍然没有完全溶解,可放在4°C过夜.待核酸完全溶解

6、后,加入约7L不含DNA 酶的RNA酶(10mg/mL,于37°C约40min.RNA酶消化后加入0.4mL3molNaAC (p H5.2和4mL T ris2饱和酚、氯仿和异戊醇混合液,混合均匀后以4400g(A24262转速离心20min,留上清.酶切分析.采用20L酶切体系(含基因组DNA约10g,用限制性内切酶Hind对所制备的基因组DNA进行酶切,48h后分别取2L、3L样品用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,经溴化乙锭染色后在紫外光下观察.2.1基因组D NA质量和浓度检测采用260/280nm波长,用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度(表1.琼脂糖凝胶电泳检测基因

7、组DNA片段大小和完整性的结果见图1.表1基因组DNA紫外光吸收值和浓度检测结果Tab.1Quality analysis of genomic DNA isolated with the improved urea Protocols by UV absorption at260/280nm 样品紫外光吸收值/(A260/A280浓度/(ng/uLB73 1.82(1.771/0.9721780M220 1.93(1.900/0.9841580B73(对照 1.80(0.959/0.534 970图1改良尿素法和改良CTAB法制备的基因组DNA电泳结果1.DNA/Hindmarker;2.玉

8、米B73;3.水稻;4.对照.Fig.1G enomic DNA bands isolated by using the improve urea protocol and the improved CTAB protocol表1结果显示,采用改良尿素法提取的玉米和水稻基因组DNA的紫外光吸收值(A260/A280450华中师范大学学报(自然科学版第42卷 以尿素法所制备的玉米基因组DNA 为模板,进行PCR 特异扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测的结果见图2.电泳所得条带清晰、单一,条带游离后所处位置与目的片段大小符合,说明PCR 扩增特异性强,且没有外源DNA 污染. 图2PCR 特异性扩增产物电

9、泳结果Fig.2G ene 2specific primer PCR amplification of maize inbred B73DNA isolated with the improvedUrea protocol1.DL2,000marker ;2.以玉米B73基因组DNA为模板扩增的PCR 产物.2.3酶切分析图3是用Hind 核酸内切酶对所制备的玉米B73基因组DNA 不完全酶切48h 后,用琼脂糖凝胶电泳检测的结果.酶切后电泳结果表明,酶切结果良好,所制备的基因组DNA 没有杂质污染,酶切48h 后电泳分离的片段大多约大于4kb ,适合用于以Sout hern 杂交为基础的基因

10、定位、基因拷贝数分析及基因序列限制性酶切片段多态性分析等遗传学研究.3讨论为了得到高质量、高纯度的基因组DNA 用于分子生物学研究,已经发展了多种提取DNA的方法124.但这些方法有一个共同点:费时、耗资大、操作程序复杂或操作处理要求的温度苛刻.而改良尿素法在汲取其它方法优点的同时,在原尿素法基础上,通过在裂解液中添加2M E 、用预冷的无水乙醇取代异丙醇沉淀核酸、采用水平离心和快速倒出用于洗涤的乙醇等操作,快速地制备到高质量、高浓度的基因组DNA.图3酶切产物电泳检测结果Fig.3L ysis analysis of maize inbred B73genomic DNA1.DL2,000m

11、arker ;223.分别为用Hind 酶切玉米B73基因组DNA 电泳结果,上样量分别为2L 和3L.表1数据结果显示,用改进的尿素方法从玉备的DNA 质量高,完全能够适用于PCR 得到好的扩增结果(图2.这些结果说明,采用改良尿素法得到DNA 完全适用于基于PCR 基础上的遗传多样性分析技术,如RA PD 和A FL P 等.由琼脂糖电泳分离结果可知,所制备的基因组DNA 分子量高而且没有RNA 污染(图1,所得到DNA 的浓度也很高(表1.用琼脂糖凝胶分离制备的玉米B73酶切片段结果证明,用该方法制备的DNA 也同样适用于基于传统的Southern 杂交基础上的遗传分析.从植物组织中提取

12、高纯度、高质量的基因组DNA ,受几个因素影响.第一,在植物叶片中,常含有大量的次生物质,如萜烯类物质、酚类物质和多糖等,极容易对DNA 造成污染.尤其是酚类物质容易氧化,与DNA 双链产生不可逆结合而第3期曹文波等:一种提取植物基因组DNA的方法改良尿素法451影响DNA溶解6.玉米叶片细胞中有高含量的酚类物质和多糖,在裂解液中加入2M E能够有效的阻止酚类物质氧化,能克服用原尿素法制备的核酸不溶问题.第二,残留污染物如大分子蛋白也能造成基因组DNA不溶.经过反复实验,我们改变了一些实验操作以克服这些问题:(1采用预冷的无水乙醇沉淀核酸,因为在冰冷的乙醇中,基因组DNA的沉降速率比其他杂质快

13、7;(2在形成絮状核酸沉淀后立即倒出无水乙醇,避免杂质与核酸发生共沉淀造成污染,使核酸处于蓬松状态,利于溶解;(3适当增加离心时间和转速,采用水平离心的方式,确保杂质能够彻底沉淀8.总之,与其它方法相比,改良尿素法具有操作简单、快速、高效、产率高等优点,经采用玉米和水稻为材料实验证明,制备的基因组DNA质量高,适用于遗传多样性、分子标记辅助选择和遗传图谱分析等研究.致谢:本实验所用的水稻材料和改良CTAB 法均由武汉大学生命科学学院何光存教授实验室提供,特此感谢!参考文献:1Doyle J J,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure forsmall

14、 quantities of fresh leaf tissueJ.Phytochem Bull, 1987,19:11215.2Dellaporta S L,Wood J,Hicks J B.A plant DNA mini2preparation:version IIJ.Plant Mol Biol Rep,1983(1: 19221.3Aras S,Duran A,Yenilmez G.Isolation of DNA for RAPDanalysis from dry leaf material of some Hesperis L.Speci2 mensJ.Plant Mol Bio

15、l Rep,2003,21:461461. 4Bhattacharjee R,K olesenikova2Allen M,Aikpodion P,et al.An improved semiautomated rapid met hod of extracting ge2 nomic DNA for molecular marker analysis in Cocoa,Theo2 broma cacao LJ.Plant Mol Biol Rep,2004,22:4352435.5Sui Z M,Chen X,Wang L Y,et al.An Improved Approachfor Syn

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18、enhai2(1.College of Life Science,Huazhong Normal University,Wuhan430079;2.Department of Biology,Yulin Normal College,Yulin,Guangxi537000Abstract:An improved protocol for t he isolation of DNA from maize and rice leaves is described.In t his paper.This protocol can easily separate plant cell geno me DNA from ot her contaminant s,such as polysaccharides and p henolic compounds.Comparing wit h t he conventional hexadecylt rimet hylammonium bromide(C TABand sodium dodecyl sulfate(SDSprot