甘蓝细胞质雄性不育材料的分子鉴定

1、甘蓝细胞质雄性不育材料的分子鉴定摘 要：根据 Genebank 中 orf224 和 orfl38 基因序列的 保守区设计特异引物，对 2个甘蓝不育材料 PM、QM 的 mtDNA进行PCR扩增。试验结果表明，orfl38特异引物对2 个不育材料的 mtDNA 扩增出 350 bp 大小的清晰条带；不育 材料的特异片段与萝卜 Ogu CMS所具有的Ogu orfl38基因同 源度达92.55%，长度均为297 bp，因此，初步推断2个不育 材料是 Ogura 胞质雄性不育类型。关键词：甘蓝；细胞质雄性不育：分子鉴定中图分类号： S635.1文献标识码： A文章编号： 1001-3547（201

2、5）08-0008-04结球甘蓝 （Brassica oleracea L var. capitata L_，属十字花 科芸薹属，为一种重要的蔬菜类作物。由于不结球白菜杂种 优势非常明显，目前国内外主要推广的品种大多数为Fi代。不结球白菜杂种一代过去主要采用自交不亲和系繁殖，但繁 殖成本较高，且亲本生活力易下降，制种时杂交率很难达到 100%，容易出现假杂种；利用雄性不育系制种，不仅亲本繁 殖容易、杂种一代纯度高，而且有利于新品种的自身保护。细胞质雄性不育（CMS）是一种不能产生有活力花粉的 母性遗传现象，是由线粒体基因组的重排引起的。 CMS 相关 基因产生一种新的蛋白质，直接或间接破坏线粒

3、体正常的生 理功能， 从而导致花粉败育， 研究证明， 高等植物 CMS 与其 线粒体基因密切相关。目前比较常见的不育类型主要有波里 马不育胞质（Pol CMS）、萝卜不育胞质（Ogu CMS）和甘蓝 型油菜不育胞质（Nap CMS）等。芸薹属中波里马不育胞质、 萝卜不育胞质研究较多，二者利用比较广泛。研究发现，几 乎所有的细胞质雄性不育均与线粒体基因变异有关，其中起 主要作用的是重要基因和未知片段重组形成的开放读码框（ORF）。人们在分子鉴定方面对不育类型进行了研究，可以 有效区分CMS类型。张德双等利用orfl38引物证实了所获得 的白菜CMS96胞质不育系 mtDNA的特异序列与 Ogu

4、CMS有 高度同源，为Ogu CMS不育类型。王春国等通过设计orfl 38特异引物对花椰菜细胞质雄性不育系和保持系进行了PCR扩增，证明所用细胞质不育材料为Ogu CMS不育类型。本试验通过提取甘蓝细胞质雄性不育材料 PM 和 QM mtDNA，设计orf138特异引物对其 mtDNA进行PCR扩增， 进而通过同源比对来鉴定 PM 和 QM 雄性不育的类型，证明 2 个雄性不育材料的分子类型，为今后研究甘蓝雄性不育的 分子机制提供一定的帮助。1 材料与方法1.1 试验材料2 个甘蓝细胞质不育品系 PM 和 QM 。1.2 试验方法 黄化苗的培育 首先取甘蓝种子 1g 左右，用清水冲洗 干净，

5、浸泡30 min，然后放置在无菌瓶中，于28 C暗培养7-10 d （定期更换补充烧杯内水源），长出的黄化幼苗即可作 为试验材料。 mtDNA提取试剂 DNase、RNase A 蛋白酶 K均为Takara产品，其余均为国产分析纯。a.匀浆缓冲液。0.4 mol/L 甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl ,pH 值 7.5; 20 mmol/L EDTA -Na2;1.0 mol/L NaCI； 0.2%BSA； 0.1%半胱氨酸； 1% PVP （BSA、 半胱氨酸和 PVP 在试验前加） 。b. 酶解缓冲液。0.4 mol/L 甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH 值

6、 7.5； 10 mmol/L MgC12 ；0.1% BSA（试验前加）。c. Shelf 缓冲液。0.5 mmol/L 甘露醇；10 mmol/LTris-HCI，pH 值 7.5；20 mmol/L EDTA-Na2。d. 裂解缓冲液。50 mmol/L Tris-HCl，pH 值 8.0 ； 20 mmol/LEDTA -Na2 5% SDS 0.1 mol/L NaCl； 0.01%B -巯基乙醇。e. EDTA溶液。0.5 mol/L , pH 值 8.0。f. DNase I 溶液。1 U/mL。g. 蛋白酶K溶液。20 mg/mL。h. 乙酸钠溶液。3 mol/L o 线粒体提

7、取a.称取20 9结球甘蓝黄化苗，在冰水中冲 洗 10 min 后擦干，放入盛有 100 mL 匀浆缓冲液的烧杯中， 置于4C冰箱15-30 min （黑暗条件下）。b. 在匀浆机中高速匀浆，每次约15 s,重复5次。用8层纱布过滤匀浆液于预冷的50 mL离心管中，滤液于1000r/min 离心 10 min 。c. 取上清液2000 r/min离心10 min后，再取上清液于2000 r/min离心15 min，重复1次，弃上清液，得到粗线粒 体沉淀。d 向每管沉淀中加入 20 mL 预冷的匀浆缓冲液，悬浮沉 淀，于 20000 r/min 离心 15 min ，充分弃掉上清液，得粗线 粒体

8、沉淀。e. 在粗线粒体沉淀中加入 1 mL预冷的酶解缓冲液，悬浮 沉淀于 2 个离心管中，后每管加入 5 mL 酶解缓冲液， 15 mL DNase，混匀后室温放置，每 5 min轻轻摇动悬浮液1次， 30 min后放入冰浴中1 h。之后每管加入600卩L EDTA容液， 混匀后室温静止 10 min 终止 DNase I 消化反应。f. 将上述溶液小心铺于 Shelf缓冲液上（每管25 mL）,于 18000 r/min 离心 20 min 后收集沉淀。再用 6 mL 酶解缓冲液 重新悬浮线粒体沉淀，并将悬浮液缓慢铺于 Shelf 缓冲液上（每管15 mL）,于18000 r/min离心20

9、 min，所得沉淀即为 纯化的线粒体。 mtDNA提取方法a.向每管沉淀中加入 6 mL酶解缓冲液，轻轻混匀后， 分装到 6 个 2 mL 离心管中， 于 18000 r/min离心15 min后弃上清液。b.每管沉淀中加入 0.9 mL裂解缓冲液，5卩L蛋白酶K,用枪头吸打沉淀，使沉淀在裂 解缓冲液中混匀，650C水浴th，同时轻摇。c. 向裂解液中加入100 mL NaAc然后加入等体积的苯酚 + 氯仿+异戊醇混合液（三者体积比 25：24：1），缓慢混匀 10 min以上，12 000 r/min离心10 min抽提DNA，收集上清液， 并重复抽提一次。d. 向上清液中加入 RNaseA

10、酶（10 mL/mL）, 37 C条件下 反应1 h,同时轻摇。e. 加入等体积的苯酚+氯仿+异戊醇混合液（三者体积比 25：24：1），缓慢混匀 10 min 以上，于 12000 r/min 离心 10 min抽提DNA,收集上清液，并重复抽提一次。f. 向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积预冷的无水乙醇，-20 C过夜沉淀，于 18000 r/min离心20 min，收 集沉淀。g. 沉淀用70%乙醇洗涤3次，置超净工作台上吹干，溶于30 mL超纯水中，-20 C保存备用。 引物设计与合成 根据 orf224 和 orfl38 基因序列的保 守区设计特异引物，委托苏州金唯智公司

11、进行引物的合成（表 1）。 PCR扩增20 mL反应体系中含IxPCR缓冲液、1卩 L DNA、2 条引物各 0.5 卩 mol、丨 U Taq酶，用ddHzO补足。PCR扩增程序：94 C预变性2 min ; 940CC变性30 s, 53 C （根据Tm设定）退火1 min , 72 C延 伸2 min，40个循环；72C保温延伸5 min , 4C下保存。扩 增产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测， 电泳结束后在紫外灯下 观察照相。 特异条带回收、纯化及mtDNA序列分析按照大连宝生物有限公司试剂盒的使用说明方法回收纯化，回收纯化后 的mtDNA于4 C贮存备用。连接体系为5卩L, 0.5

12、卩LpGEM-T载体，0.5卩L连接酶，2.5卩L 2x连接酶，1.5卩L PCR 产物。经蓝白斑筛选，EcoR I酶切、电泳检测后委托苏州金 唯智生物技术有限公司进行DNA测序。用DNAMAN软件进行同源性序列比对分析。2 结果与分析2.1 甘蓝不育材料 mtDNA 检测结果经测定，提取的 mtDNA 的 OD260/0D280 值在 1.6-1.8， OD260/OD230>2.0， 0.8%琼脂糖凝胶电泳结果显示，电泳条 带清晰（图 1），表明所提取的 mtDNA 质量满足进行后面试 验的要求。2.2 0rfl38和orf224特异引物的 PCR结果用设计的 orfl38、 orf

13、224 特异引物对 2个甘蓝供试材料 的mtDNA进行PCR扩增。用orf138设计的特异引物对 2个 甘蓝材料进行PCR扩增，2个不育系PM、QM均扩增出350 bp 左右的条带（图 2）；而用设计的 orf224 特异引物对 2 个 不育材料进行PCR扩增，不育系均没有扩增产生条带。2.3 序列的同源性比较利用pGEM-T载体连接，经蓝白斑筛选，EcoR I酶切、电泳检测，条带清晰明显（图3），故可以进行测序，选用orf138 特异引物扩增出条带的供试材料克隆进行测序。利用 DNAMAN 软件对测序结果进行分析， 结果表明， 这 2 个序列都与已知的萝卜 Ogura 雄性不育线粒体基因组的

14、部 分序列存在很高的相似性，但是有个别位点存在差异，2 个片段与 Ogu 型胞质不育萝卜线粒体开放读码框orf138 同源性均为92.55% （图4），长度为297 bp，证明2个来源不同的 甘蓝雄性不育供试材料均属于萝卜细胞质不育类型Ogu CMS。3 讨论与结论 在十字花科作物的细胞质雄性不育材料中，已经发现了 很多特异性存在于不育系的开放阅读框中，如不育系甜菜的 orf239、萝卜的orfl38、白菜的orf222、油菜的orf224及芥 菜的orf220等。Ogu CMS是于1968年在日本鹿儿岛一个萝 卜品种留种田中发现的一种新型胞质不育系，是目前国内外 十字花科芸薹属中应用较为广泛的一种不育类型。李建斌等 利用多个结球甘蓝胞质雄性不育材料，通过对 orfl38 和 orf222基因进行PCR结果显示其中的59个材料含有orfl38。张艳等利用 Ogu CMS的orfl38特异引物及 Nap CMS和PolCMS的共同引物，在15份甘蓝CMS材料中鉴定出了有14 份是Ogu CMSo本文通过已知引物设计了2组特异引物，发现 orfl38 特异引物在甘蓝雄性不育材料都有扩增产物 .0rf224 特异引物在甘蓝雄性不育材料没有扩增产物。经测序分析后 发现，这2个来源不同的甘蓝雄性不育材料与Ogura型胞质不育萝卜线粒体开放阅读框 orfl38 的同源性