用积分法考察黄嘌呤对candidaspecies尿酸酶的抑制作用

1、用积分法考察黄嘌呤对 Candida species 尿酸酶的抑制作 用【关键 词 】尿 酸酶 haraterizatinfinhibitinfxanthinenandidaspeiesuriasebyintegratedethd【Abstrat 】AI:Tinvestigatetheprerequisiteftheintegratedethdfrharaterizing【关键词】 尿酸酶haraterizatin f inhibitin f xanthine n andida speies uriase by integrated ethd【Abstrat】 AI: T investigat

2、e the prerequisite f the integrated ethd fr haraterizing inhibitrs ith the inhibitin f xanthine n andida speies uriase as the del. ETHDS: Uriase reatin urve as nitred by absrbane at 293 n. The apparent kineti paraeters (apparent ihaelisenten nstant, Kapp, and apparent axial reatin rate, Vapp) ere es

3、tiated by nnlinear fitting reatin urve t the integrated ihaelisenten rate equatin ith the preditr variable f reatin tie. The inhibitin type and inhibitin nstant (Ki) ere deterined based n the respnses f apparent kineti paraeters t xanthine nentratins. RESULTS: utliers in reatin urve greatly redued t

4、he reliability f paraeters btained by this integrated ethd. ith residual substrate bel nesixth f Kapp and initial substrate high enugh, this integrated ethd usually shed deviatin bel 20% fr Kapp and saller deviatin fr Vapp. By this integrated ethd ith the sae range f data fr analysis, Kapp as nsiste

5、nt t that by LineeaverBurk plt and the respnse f Kapp t xanthine nentratins gave inhibitin nstant f (5.4 ± 0.8) 卩 l/L (n=3), als nsistent t that by LineeaverBurk plt. NLUSIN: This integrated ethd is feasible fr fast sreening f speial inhibitrs ith data f higher preisin and initial substrate abv

6、e furfld f ihaelisenten nstant (K) in the absene f inhibitr and residual substrate bel nesixth f this K fr analysis.【Keyrds】 Integrated ethd; LineeaverBurk plt; uriase; xanthine; ihaelisenten nstant; inhibitin nstant【摘要】 目的 : 以 andida speies 尿酸酶为模型， 考察用积分法筛选抑制剂的条件 . 方法 : 用 293 n 吸收记录尿酸酶反应 . 用反应为自变量的

7、积分速度方程拟合反应曲线表观米氏常数 (apparent ihaelisenten nstant, Kapp) 和表观最大反应速度 (apparent axial reatin rate, Vapp). 据 上述参数随抑制剂浓度的抑制类型和抑制常数 (inhibitin nstant, Ki). 结果 : 被分析数据中的畸 异值降低结果性.通常终点底物1/6 Kapp而起始底物足够高，此积分法测定Kapp的偏差和变异低于20 %而Vapp精度更高.用积分法所得 Kapp与双倒数法，且和黄嘌呤浓度成正比， 对应Ki为(5.4 ± 0.8)卩l/L (n=3)，也与双倒数法.结论：被分析

8、数据精度足够高，用无抑制剂时米氏常数(ihaelisenten nstant, K) 4倍的起始底物浓度并固定终点底物浓度1/6 K,此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂 .【关键词】 积分法； 双倒数分析法； 尿酸酶； 黄嘌呤； 米氏常数； 抑制常数 0 引言酶抑制剂是新药开发热点 . 通常据表观米氏常数( apparent ihaelisenten nstant, Kapp )和表 观最大反应速度(即pare nt axial reat in rate, Vapp)随抑制剂浓度同步抑制类型和抑制常数(inhibitin nstant, Ki )筛选抑制剂1.双倒数法测定 Kapp和Vapp筛

9、选抑制剂需要底物浓 度分布在米氏常数(ihaelisenten nstant, K)两侧，且范围应尽量宽.此法测定动力学参数对低 浓度底物下初速度误差和底物浓度本身的误差都非常敏感，用于筛选抑制剂的成本也 . 用积分速度方程酶反应曲线，即积分法，可同步K和最大反应速度(axial reatin rate, V).经典积分法所用积分速度方程自变量统计性，所得参数性低2 . 最近用以反应为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，能测定酶动力学参数并筛选抑制剂3-7 . 此积分法筛选抑制剂对初始底物浓度误差不敏感， 且高而成本低 . 用此积分法考察黄嘌呤对 andida speies 尿酸酶 的抑制作用

10、，以期此法筛选抑制剂的性和应用条件 .1 材料和方法1.1 材料尿酸、黄嘌呤购自 IN, andida speies 尿酸酶 (E. 购自 Siga U 0880 . 其余试剂为国 产分析纯 .1.2 方法缓冲液含100卩I/L二乙基三氨基五乙酸6,7:.反应体系含1.0 L缓冲液，底物、抑制剂 和酶液共0.20 L.用双倒数法分析时，酶为0.083卩kat/L，记录反应延迟 30 s后反应1 in内的数据积分法分析时，酶为 0.333卩kat/L，初始底物浓度为 55卩I/L ,在(25 ± 0.5) C以10 s间隔记录启动反应 40 s后底物消耗到1/8 Kapp(双倒数法测定

11、)的反应曲线.用线性回归双 倒数法所得参数积分法测定参数按以前方法分析启动反应40 s后光吸收0.001的6个数据7. 用 VisuaI Basi 6.0编写程序，数据记录成文件读入，作图鉴别畸异值，结果输出到指 定文件 . 线性回归分析 Kapp 及 1/Vapp 随抑制剂浓度的对应的抑制常数 . 两种抑制常数的统 计性和大小抑制类型8.统计学：结果用x±s表示，用SAS 8.2分折数据，P 0.05为有统计学差异 .2 结果双倒数法分析无抑制剂时970卩l/L底物下初速度得 K为(6.2 ± 0.8)卩l/L (n=3).用积分法分析起点为 40卩l/L而终点接近1.0

12、卩l/L反应曲线得K为(6.3± 0.8)卩l/L (n=8).两种 方法无差异( P 0.5) . 反应初始阶段畸异值对积分法结果很小，但在底物浓度降低到接近K时即使0.001的光吸收偏差可 K的偏差达20% .升高终点底物浓度常K负偏差，降低起点底物浓度正偏差.如被分析数据中畸异值，起点底物浓度在双倒数法所得K的2倍，终点底物浓度在1/6 K波动时积分法所得 K 15%，而V的常10%.如终点底物浓度3.0卩l/L，起始底物40卩l/L时所得K变异和偏差也接近 20 % .如起始底物浓度远K,则剩余底物浓度黄嘌呤为18卩l/L时双倒数法所得 Kapp 30卩l/L.用黄嘌呤升高K

13、app后积分法对畸异值的 敏感性降低 . 如起始底物浓度 双倒数法所得 Kapp 的 1.4 倍，与双倒数法偏差 20%的 Kapp 所需剩余底物浓度与黄嘌呤浓度正.固定起始底物浓度为40卩l/L,在5卩l/L黄嘌呤时需终点底物浓度1.5卩l/L, 13卩l/L黄嘌呤时需终点底物浓度3.0卩l/L, 18卩l/L黄嘌呤时需终点底物浓度4.0卩I/L,所得Kapp偏差才可15% .分析起始底物浓度接近40卩l/L而终点底物浓度接近1.0卩l/L的反应曲线，积分法所得Kapp与双倒数法，且与抑制剂浓度成 正比.据Kapp的，积分法得 Ki为(5.4 ± 0.8)卩l/L (n=3)，双倒

14、数法得 Ki为(5.0 ± 0.4)卩l /L (n=3),二者也无差异(Tab 1).重复测定抑制常数时两种方法所得Vapp都有一次随黄嘌呤浓度升高而下降，但分析1/Vapp所得Ki都高于分析Kapp所得Ki的17倍.表1表观动力学参数对黄嘌呤浓度(I)的响应(略)3本结果表明 ,条件下此积分法能测定 Kapp 和 Vapp. 测定黄嘌呤抑制下的 andida speies 尿酸 酶动力学参数时， 起始底物浓度越高则此积分法所允许的终点剩余底物浓度也越高，但所允许的终点剩余底物浓度都需要1/6 Ka12下一页【pp. andida utilis尿酸酶K接近12卩l/L，此积分法在起

15、点K时测定其K也需剩余底物浓度2卩l/L : 7.，当起始底物浓度Kapp时，终点剩余底物浓度1/6 Kapp是此积分法测定动力学参数的必要条件.0.8卩l/L尿酸的吸收0.010.按光吸收随机误差为0.001推算，测定0.8卩l/L尿酸的误差在10 % .以剩余底物浓度1/6 Kapp和底物定量下限为 0.8卩l/L为前提，此积分法测定K下限接近5卩I/L,与模拟分析结果7.用积分法和双倒数法考察黄嘌呤对 andida speies 尿酸酶的抑制作用时， Vapp 随黄嘌呤浓度增大而偶尔略降低源自实验 误差，而黄嘌呤对 Kapp非常的说明其andida speies尿酸酶仍然是竞争性抑制剂.

16、所述积分速度方程自变量为反应，方程统计性高，结果更 . 自动记录反应曲线有利于畸异值 . 分析启 动反应40 s后的数据可保障分析稳态反应数据.调节酶活性使启动反应40 s后底物浓度维持在4倍K(无抑制剂时)，则此积分法允许竞争性抑制剂浓度在其抑制常数的两倍范围内波动.非竞争性抑制剂不酶K,故用积分法筛选此类抑制剂时允许抑制剂浓度在更宽范围内且所需底物浓度更低 . ，反应曲线可连续记录、产物无抑制作用且反应不可逆的米氏酶，固定终点 底物浓度1/6 K,记录4倍K起始底物浓度下的反应曲线，抑制剂浓度使得被分析起点的底 物浓度在对应 Kapp的1.4倍，用此积分法就有望低成本测定表观动力学参数，并

17、筛选其竞 争性和非竞争性抑制剂 .【参考文献】 1 Kakkar T, Pak Y, ayershn . Evaluatin f a inial experiental design fr deterinatin f enzye kineti paraeters and inhibitin ehanis J . J Pharl Exp Ther, 2000； 293(5): 861-869. 2 廖飞，张晓萍，周歧新，等 . 离子交换高效液相层析分析兔肝磷酸二酯酶反应体系 J. 重庆医科大学学报，2001 ；26(1 ) ：20-22.Lia F, Zhang XP, Zhu QX, et a

18、l. Inexhange highperfrane liquid hratgraphy analysis f the reatin ixture f rabbit liver phsphdiesterase J . J hngqing Univ ed Si, 2001;26(1):20-22. 3 Lia F, Liu L, Zhu QX, et al. Assay f seru arylesterase ativity by fitting t the reatin urve ith an integrated rate equatinthe J . lin hi Ata, 2001; 314(1/2): 67-76. 4 Lia F, Tian K, Yang X, et al. Kineti substrate quantifiatin by nnlinear fitting reatin urve t the integrated ihaelisenten equatin J. Anal Bianal he, 2003; 375(6): 756-762.5 Lia F, Li J, Kang GF, et al. easureent f use