蛋白质含量的测定(Folin―酚法)

1、实验报告实验名称:蛋白质含量的测定(Folin-酚法实验日期:班级:学生姓名:研究背景与目的:蛋白质是生物最重要的基本组成成份之一, 蛋白质的定量分析方法的研究在国际上一直十分活跃,Folin-酚法是一种灵敏度极高,可快速测定蛋白质含量的方法,广泛地应用于蛋白质含量的测定。本实验培养掌握使用Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和操作方法,同时熟练722分光光度计的使用和比色法。实验原理:Folin-试剂是由两部分组成,甲试剂相当于双缩脲试剂,在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜离子结合生成络合物。试剂乙是磷钨酸和磷钼酸的混合液,在碱性条件下极不稳定,易被蛋白质和试剂甲生成的络合物还原,生成钼蓝和钨

2、蓝混合物而呈蓝色反应。根据此试剂与蛋白质的反应以及一定条件下,兰色深度与蛋白的量成正比,可用比色法,使用分光光度计,通过对呈现蓝色的混合物进行浓度测定,再依据比例计算出蛋白质含量。仪器与试剂:722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司架盘天平具塞刻度试管8支15ml移液器100ul-1000ul和1ml-5ml容量瓶50ml*1小烧杯漏斗研钵Folin酚试剂:试剂甲试剂乙250ug/ml牛血清白蛋白标准原液材料:绿豆芽下胚轴实验步骤:1.标准曲线的绘制取6支15ml具塞刻度试管,编号。如下表所列加入相应试剂。 2.样品测定(1称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中,匀浆。转入50ml容量瓶中,定容。然后

3、过滤,滤液即为样品液。(2取具塞刻度试管2支,编号8、9,分别加入滤液1ml,分别加入试剂甲5ml,混匀后放置10分钟,然后各加入试剂乙0.5ml,迅速混匀,室温下放置半小时,于650nm波长下比色,记录消光值,取其平均值完成计算。数据整理与计算: 表1Folin-酚法测蛋白质含量的标准曲线 图1从标准曲线中查得样品的OD650平均值对应的蛋白质含量X(ug/ml=71ug/ml,然后按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。样品中蛋白质含量(%=X(ug/ml*样品总体积(ml*100样品重(g*106将数据X(ug/ml=71ug/ml代入公式样品中蛋白质含量(%=71*50*100/(1*1

4、06=0.355%结果分析:经过本实验的数据计算,得到绿豆芽中蛋白质含量为0.355%,而网络上查得的绿豆芽中蛋白质含量为2.2%,与实验测得相差一个数量级,但是与其他实验组的同学讨论得知,所测得的含量都与我组所测的数量级相同。分析可知,豆芽的品种不同,生长所需要的条件和时间也不尽相同,所以与网络查得的数据比较价值很小,而与其他组比较可知我组数据相对准确。参考文献: 蛋白质含量的测定 Folin酚法测定血清蛋白质含量思考题:1.为什么要求加入试剂乙后立即混匀?否则将会如何影响测定结果?已知试剂乙未磷钨酸和磷钼酸混合液,乙试剂在酸性条件下较稳定,在碱性条件下极不稳定。又知Folin-酚甲试剂是在

5、碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液,所以加入试剂乙后要立即混匀,以便在在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前,使还原反应发生。否则试剂乙含量减少,使得蛋白质与试剂甲作用后的溶液不能完全反应,以致所测蛋白质含量偏低。2.试分析本实验方法中的干扰因素本实验方法中从物质角度分析蛋白质中氨基酸的R基团中的酚类物质,豆芽中的柠檬酸、甘氨酸、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。从实验过程分析,反应的操作时间不易控制,如:加入试剂乙后迅速混匀等。3.为什么测定同一类甚至同一种物质的含量会有多种测定方法?每一种测量方法都有各自的特点,即各有各的优缺点,如:Bradford法和Lowry法灵敏度最高,定氮法更准确,但也更加复杂。因为某一种并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质含量测定,于是,我们在选择测量方法时,要考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度,蛋白质性质,溶液中存在的干扰因素,测定所要花费的时间等等方面。所以会有多种测定方法。4.在Folin-酚法中,试剂甲的作用是什么?试剂甲的作用是与蛋白质中的肽键形成络合物,使其可以还原磷钨酸和磷钼酸,另外试剂甲可以为试剂乙的反应提供一个碱性环境。实验小结:在这一次的实验中,我与同伴的配合更加默契。在预习本实验时,我对此次实验操作所预测的时间为80分钟,但是实际操作中,实际用时为