植物叶片衰老过程中的基因表达与调控

1、    植物叶片衰老过程中的基因表达与调控姚真高燕萍杨金水 中图分类号：Q945.17+4;Q943.2文献标识码：A文章编号：0253-9772(1999)04-0063-65 Gene Expression and Regulation in Leaf Senescence YAO Zhen,GAOYan-Ping,YANG Jing-Shui (Institute of Genetics,Fudan University,Shanghai 200433,China) 衰老是一种器官或组织逐步走向功能衰退和死亡的变化过程1。它除了代表器官或组织生命周

2、期的终结之外，在发育生物学上也有着重要的意义。叶片的衰老是植物的一个重要发育阶段。在这段时期内，植物在成熟叶片内积累的物质，包括大量的氮、碳有机化合物和矿物质，将被分解并运送至植物其它生长旺盛的部分，其中大部分被转移到种子内，为下一代的生长做好准备11。对于产生种子的作物，包括绝大多数农作物，这种转移使营养重新分配，对植株保持正常的生长发育与繁殖是十分必要的3。衰老过程中，叶片细胞在组成成分上有很大的变化。据分析，总RNA减少了十分之一，可溶性蛋白减少了三分之一10。叶组织衰老的表型以叶绿素的流失为标记，随之出现叶绿体的分解，叶色褪淡。在分子水平上，衰老过程中叶绿素、蛋白质、RNA和DNA不断

3、减少，水解酶和生长抑制因子则持续增长15。叶片衰老在许多物种中的发生是依赖于植株年龄的，因此靠近植株根部的叶片比顶端叶片更早进入衰老。同时它也能被一系列外部因子所诱导，其中包括阴暗、缺乏矿物质、干燥与病原体感染等17。其它一些发育过程也能诱导衰老的发生，如开花、受精与种子发育6, 11。 最初RNA合成的减少被认为是衰老的主要原因，这一结论基于以下几个发现。首先，叶片衰老过程中RNA水平与蛋白质含量同步减少，而DNA的减少速度则慢得多15。其次，能够延迟衰老的物质能够增加RNA的合成，反之亦然18。但是，抑制因子研究表明叶片衰老对转录抑制因子放线菌丝素D不敏感，而在转译抑制因子放线菌酮的作用下

4、，衰老延迟16, 20。由此推测涉及叶片衷老的大多数事件发生在转译水平上，而非转录水平17。 1衰老中基因表达产物的变化 生理与遗传研究显示衰老是一个高度程序化的调控过程11, 17。这一过程包括了大量有序事件发生，如叶片蛋白质的分解、光合作用能力的下降、叶绿体的解体、叶绿素的流失以及分解产物的撤离等，涉及一些相关基因的表达11。衰老过程中表达量上升的蛋白包括以下这样几种类型：蛋白酶、核酸酶等参与营养物质分解代谢的酶类；参与叶绿素和叶绿体分解的酶类；衰老调控蛋白因子等17, 19。另外，某些在植物果实成熟期表达的基因，如乙烯合成酶基因，在衰老时期也很活跃。而光合作用相关蛋白的含量则下降4。 在

5、衰老初始时期被诱导表达的基因很可能是控制衰老的关键基因，但这种衰老特异基因是否存在, 目前尚未证明。RNA-DNA杂交实验的结果显示，大麦幼苗的7日龄和17日龄叶片的总RNA之间没有区别13。在最近的一项研究中，用含有polyA的RNA进行体外转译，然后检测转译产物发现，离体小麦叶片在暗环境下的衰老过程中，至少有12种差异的多肽产物出现21。但这一研究并未区分这些差异是衰老本身造成的基因表达变化，还是光暗之间转换引起的基因表达变化，而许多植物基因表达是由光调控的。4 从番茄叶片的cDNA文库存中分离出一些衰老相关的cDNA克隆，其中有衰老上调基因（SENU1、SENU4、SENU5）和衰老下调

6、基因（SEND3236）5。Southern杂交显示，SEND32是一个单拷贝基因，而SEND3336以及SENU1、SENU5都是一些基因家族中的成员。在已知功能的基因中，SEND33编码铁氧还蛋白，SENU34编码系统的10kD蛋白，SEND36编码降解酶。SENU4蛋白与一种致病性相关蛋白P6有一定同源性。三种上调基因mRNA水平在衰老叶片中都有上升，其中SENU1与SENU5在叶片及其它器官中的表达水平也相当高。因此，似乎SENU4更加特异地针对叶片衰老。所有衰老期间下调的基因在衰老时表达量都下降，并且除了SEND32之外，其它在非叶片部位的表达水平也相当低。 在拟南芥中分离到四种表型

7、为叶片衰老延迟的突变12。通过遗传分析发现它们都是单基因隐性突变，可分为三个互补群，分别对应拟南芥中控制叶片衰老的三个基因位点。这三个位点的突变可引起所有衰老表征，如叶绿素含量下降、光系统的光化学效率减退、Rubisco大亚基的相对数量减少、RNase和过氧化酶的活性降低等。含有突变的植物中，无论是自然衰老，或是暗诱导的人工衰老，都表现出叶片衰老推迟。以上结果显示这三个基因位点是控制叶片衰老的关键遗传因素，其中一个基因的突变是乙烯不敏感突变, 证明乙烯在拟南芥叶片衰老信号传导过程中发挥了重要作用。通过脉冲标记方法发现，编码叶绿体rRNA的RRN基因和编码LSU蛋白（Rubisco蛋白的大亚基）

8、的rbcl基因，它们的转录量在总RNA量中的比例不变，而编码LHCP（26kD）和编码SSU蛋白（Rubisco的小亚基）的基因cab 和rbcS在衰老过程中其mRNA量占总RNA的比例显著下降。前两者是叶绿体基因，后两者是核编码基因。同时，一种核编码的与光合作用无关的过氧化物酶，在这一过程中含量不变。这说明, 在衰老的叶片中，与光合作用有关的核基因与叶绿体基因受到不同的调控。 psbA基因编码了光系统的D-1蛋白，psaA/B 基因编码了光系统I的68kD和70kD蛋白，atpB/E基因编码了ATP酶亚基。这几种蛋白的转录水平在衰老过程中都有减少，但在合成量方面只有后两者发生下降。与多聚体结

9、合的psbA转录产物，在衰老叶片中占总RNA的比例要比幼嫩叶片中的高。而psaA/B 和atpB/E则正相反，形成多聚体的信号量在衰老叶片中减少。因此，D-1蛋白在衰老叶片中继续合成的原因似乎是psbA的转录产物使核糖体优先汇集，这种能力也许与D-1蛋白的高周转率有关9。 2水解酶在衰老中的作用 衰老叶片中RNA与蛋白质含量上的变化是由两方面的因素造成的。其一是基因表达的调控使某些基因产物合成减少；其二是由于水解酶的异常表达加速了细胞内生物大分子的降解8。用PCR方法从番茄中分离得到两个衰老诱导的RNase基因的cDNA克隆。将它们同衰老诱变的转录产物杂交，发现这两个克隆分别对应番茄中的LX-

10、RNase与LE-RNase7。在衰老程度较高的时期，LX的诱导表达量比LE更高。在衰老的花和离体叶片中，RNase基因表达较低，而在茎、根及不同成熟阶段的果实中没有表达。幼年离体叶片中，LX基因的表达可被乙烯活化，而LE则被脱落酸活化。另外，外部伤害也可导致LE的暂时表达。因此LX可能在衰老时期的RNA代谢中起作用，而LE则可能与植物受伤时的主动防御有关。尽管已经发现了一些衰老诱导的水解酶基因，但是由于植物细胞中那些非诱导的降解酶一般具有比较高的背景，这方面的工作有待进一步深入。 植物衰老中，质膜崩解是一个至关重要的过程。磷脂酶（PLD）在其中起着关键作用2。磷脂酶是拟南芥中最为普遍的一种磷

11、脂酶，它的表达能被反义cDNA片断抑制。缺乏PLD的转基因植物的离体叶片在脱落酸与乙烯中培养，其衰老过程比野生型慢。衰老水平的衡量标准是叶片黄化程度、离子渗漏量、光合作用活性、叶绿素与磷脂含量。脱落酸与乙烯的处理能使PLD的mRNA、蛋白质水平及其活性上升。在没有上述两种处理的情况下，转基因植株与野生型在衰老速度上是相近的。另外，PLD的抑制并未改变植物的自然生长与发育。因此，磷脂酶被认为是在离体叶片中由植物激素启动的触发衰老的重要媒介，而并非自然衰老中的直接启动因子。 3植株衰老的遗传操纵 叶片的衰老控制与细胞分裂素有密切关联，衰老叶片中细胞分裂素水平出现明显下降。将合成细胞分裂素的ipt（

12、isopenteny1 transferase）基因转化烟草细胞，可使转基因植株叶片延缓衰老。研究还发现，当细胞分裂素只在衰老叶片中产生时，植物本身有一种自主调控系统可阻止激素的过度合成14。 构建这种自主调控的衰老抑制系统是按以下步骤进行的。拟南芥的SAG12基因的表达是衰老特异性的。把SAG的启动子与ipt基因的编码区相连，构建P-12-IPT，转基因表达，使细胞分裂素的含量不断提高，到达可抑制叶片衰老进程的水平。这种抑制作用紧接着就会反过来减弱ipt基因的转录，防止细胞分裂素的过度合成。ipt转基因植株除抑制叶片衰老外，不影响其它发育过程, 但能延长有效光合作用的时期。 为了证明PSAG

13、12-IPT的SAG12启动子的反馈抑制，Susheng Gan和Richard M. Amasino构建另一种融合基因PSAG12-GUS，其中gus作为报告基因。将含有PSAG12-IPT与PSAG12-GUS的纯合植株杂交，获得同时具有这两个转基因位点的后代。在只有PSAG12-GUS转基因植株中，GUS活性在衰老出现后的71天里，随着衰老的进程增加到最高水平，直到叶片干枯。在有PSAG12-IPT的情况下，gus表达水平下降了1 000倍，叶片寿命增加，衰老相应延迟。因此, 通过转基因技术延缓植株衰老对增加作物的干重及籽粒产量有潜在的应用价值。 作者简介：姚真（1968-），男，现在美

14、国北卡罗莱纳州立大学攻读博士学位，专业方向：遗传学。 作者单位：姚真高燕萍杨金水复旦大学遗传研究所，上海200433 参考文献： 1Cai Zhong Jiang, et al.Photosynthesis, rubisco activity and amount, their regulation by transcription in senescing soybean leavesJ. Plant Physiol., 1993, 101: 105112. 2Fan L, et al. Antisense suppression of phospholipase D alpha retar

15、ds abscisic acidand ethylene-Promoted Senescence of postharvestArabidopsisleavesJ. Plant Cell. 1997, 9(12): 21832196. 3Feller U, Keist N. Fundamental, ecological and agricultural aspects of nitrogen metabolism in higher plantsM. Martinus Ni Jhoff Publishers. 1986, 219234. 4Heinze H, et al.Light indu

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18、t Mol. Biol., 1995, 29(2): 379384. 9Marie J Droillard, et al.Active translation of the D-1 protein of photosystem in senescence leavesJ. Plant Physiol., 1992, 99: 589594. 10Nicholas J Bate, et al.Expression of nuclear and cloroplast photosynthesis-specific genes during leaf senscenceJ. Journal of Ex

19、perimental Botany, 1991, 42(239): 801811. 11Nooden L D. Senescence and aging in plantsM. New York. Academic Press, 1988, 150. 12Oh S A, et al.Identification of three genetic loci comtrolling leaf senescence inArabidopsisthalianaJ.Plant J. 1997, 12(3): 527535. 13Srivastava B I S. RNA-DNA hybridizatio

20、n competition studies on senescing barley leavesJ. New Phytol., 1972, 71: 9397. 14Susheng G, Richard M A. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokininJ. Science, 1995, 270: 19861988. 15Thimann K V. Senescence in PlantsM. CRC Press, 1982, 85115. 16Thomas H. Regulation of alanine aminotransferase in leaves ofLolium temulentumduring senescen