微生物操作培训大纲

1、微生物检验技术培训大纲一玻璃器皿准备（1）玻璃器皿的清洗新购进玻璃器皿处理新构进的玻璃器皿，均含有游离碱，故应先浸于洗液或20ml/L 盐酸内数小时，再用自来水冲洗干净。待干燥后，灭菌备用。日常清洗注意事项a.一切使用过得玻璃器皿，用完后先用清水冲洗干净，然后用热的肥皂水洗刷清洁，再用清水冲数次，蒸馏水冲洗两次，自然风干，备用。如果肥皂水洗刷仍未清洁，可用洗液浸泡，洗出后用清水冲洗5 次以上，再用蒸馏水冲洗两次。b. 吸管用完后应立即用清水和蒸馏水冲洗干净即可，如附有污物可用洗液浸泡。c. 附有油污的器皿，若用热的肥皂水不能洗净时，切不可用洗液浸泡，而应先用热的酒精、汽油或丙醇洗涤 ; 或用氢

2、氧化钠热溶液 2（）浸泡 10-15 分钟，然后再用稀盐酸洗一次，用水冲洗数次。油污如仍未出去，再重复以上手续一次。洗液的配制和使用：a. 在 35ml 重铬酸钾饱和液（重铬酸钾 180g 溶于 100ml 水中，或 63g 重铬酸钾溶于 35g 水中），慢慢加入粗制浓硫酸 1000ml 玻璃器皿一般在这种洗液中浸泡 2h 以上即可除污。如将其加热至 80-100 （但不可加热至发烟或煮沸，此时温度达 240-250 ），浸泡 10-15 分钟，效力更大。b. 溶解 80g 重铬酸钾于 1000ml 温水中，待凉后，徐徐加入粗制浓硫酸 100ml 于水中即成含硫酸 10的清洗液，使用时，将玻璃

3、器皿先浸于这种洗液中24h，然后清水和蒸馏水冲洗。c.溶 60g 重铬酸钾于 300ml 热水中，慢慢加入粗制浓硫酸 460ml，边加边用玻璃棒搅拌，因为此液产生大量热，在配制时应用耐热容器，并放在水槽中以便冷却。一般玻璃器皿在此溶液中浸泡6h 以上即可。如何判定清洗干净既不聚成水滴，也不成股流下。（2）微生物检测常用玻璃器皿及规格所用玻璃仪器及规格：吸管： 1ml 和 10ml，标有 0.1ml 刻度平皿：皿底直径为9cm试管： 15×150mm、 18×180mm、 20×200mm、酒精灯三角瓶： 250ml、300ml广口瓶：用于采样大肠菌群：双料 : 、

4、单料、复发酵1单料乳糖胆盐发酵管： 20g 蛋白胨、 10g 乳糖、 5g 胆盐 、1.6 溴甲酚紫乙醇溶液 0.6ml （0.04 溴甲酚紫水溶液 25ml）、蒸馏水 100制法：将各成分溶于 1000ml 水中，溶解后将 PH值调至 7.4 分装于 18× 180mm试管中， 115C高压灭菌 15 分钟。双料乳糖胆盐发酵管：单料除水外其他各成分加倍,分装于 18× 180mm试管中 .乳糖发酵管： 20g 蛋白胨 10g 乳糖 1.6 溴甲酚紫乙醇溶液0.6ml （0.04 溴甲酚紫水溶液 25ml）蒸馏水 1000ml PH 值调至 7.4 取 3ml 分装于 12

5、×120mm试管中， 1150C 高压灭菌 15 分钟。（3）玻璃器皿的准备、包扎、高压灭菌条件棉塞制备：用普通棉花纱布做成所需大小的棉塞，高压灭菌固定。吸管：在吸管的上端塞上一小段棉花，防止吸管中的菌液、酸液、碱液等吸入口中。塞入的棉花应与吸管口保持5mm左右的距离棉花全长不短于10mm，赛好棉花后用截成条的旧报纸包装，先把吸管的尖端放在纸条的一端， 45 度角折叠纸条，包住尖端。以螺旋式包扎剩余的纸条折叠打结，也可把塞好棉花的吸管放入铁皮筒中，加盖密封1210C 高压灭菌 15 分钟。平皿：用过的培养皿中有废弃的培养基，为了防止杂菌传播污染环境，也应先经高压灭菌或沸水煮沸半小时后

6、，倒掉污物洗涤。新的培养皿可直接洗刷，洗净后用蒸馏水冲洗三次，培养皿全部向下，一个接一个压着皿边，然后扣在桌子上空净水。用报纸包好或装在铁皮筒中， 1210 C15分钟。三角瓶：洗刷干净的三角瓶塞上塞子用截成方块的旧报纸包好，用绳子捆住。二培养基选用、配制、成分作用、高压灭菌条件（表格）检验项目培养基配制成分作用高压灭菌条件菌落总数营养琼脂按说明分装于 300ml 三琼脂：凝固剂1210C15分角瓶中1150C15分大肠菌群乳糖胆盐蛋白胨：氮源发酵管乳糖：碳源胆盐：抑菌剂伊红美兰按说明分装于 300ml 三伊红美兰：鉴1210C15分琼脂角瓶中别性培养基乳糖发酵1150C15分管霉菌、酵孟加拉

7、红按说明分装氯霉素：抑制1210C15分母菌琼脂杂菌生长菌嗜冷菌营养琼脂按说明分装于 300ml 三1210C15分（常规）角瓶中1210C15分嗜冷菌酵母提取物 2.5g 胰蛋（快速）白胨 5.0g 脱脂奶粉1.0g 葡萄糖 1.0g 琼脂10-15g 蒸馏水1000mlPH值 6.91210C15分芽孢及耐营养琼脂同上2热芽孢三高压锅正确使用方法及注意事项使用规则1）松开紧固螺杆，将器盖翻开，放入消毒物后，为胆内注水，并观测水位至最高水位线即可，在顺时针方向拧紧螺杆后，消毒器就可以接通电源。2）加热时，应把放气阀推向垂直放气的位置，使冷空气加热由筒内逸出。3）等较急的蒸汽冒出时，关闭蒸汽阀

8、直至压力表指针上升至消毒物所需压力后开始记消毒灭菌时间。4）消毒完毕，切断电源，开启上边放气阀，待汽排尽压力表指针回到0时才能打开器盖，开启下面放水阀，排放胆内热水。5）对瓶装溶液消毒完毕压力表指针回到 0 后，必须在放汽水咀打开下，等冷却 20 分钟左右，方能打开器盖，否则溶液瓶回因突然遇冷而发生爆炸事故。6）每次使用完毕应擦干各部件，以防生锈。注意事项1）严禁使用不在有效期内的或其它型号的压力表和安全阀2）该仪器使用一年时必须进行外部检查，使用三年时，必须进行内外部检查；使用六年时，必须进行全面检查。3）严禁在消毒器内有压力时打开器盖。4）盖上器盖时应轻旋，并在橡胶圈上涂上滑石粉，提高密封

9、圈使用寿命。5）不用时消毒器应放在通风处。四灭菌后培养基的存放注意事项最好及时用完，不宜保存过久，以免减低其营养价值或化学变化。培养基在储存期间，因能吸收空气中的二氧化碳而变为酸性。五无菌室注意事项（人员、环境、灭菌要求）1. 无菌室要保持清洁整齐，室内仅存放最必须的检验用品，如：酒精灯、酒精棉、火柴、镊子、接种针、接种环、记号铅等。2. 室内检验用具及桌凳应保持固定位置，不随便移动。3.每 23 周用 2%石碳酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌凳及地面，然后用 2% 石碳酸水溶液喷雾消毒空气，最后紫外灯杀菌半小时。4. 定期检查室内空气无菌状态，进行细菌和霉菌的检查。35. 无菌室杀菌前应将所有

10、物品置于操作之部位，然后打开紫外灯杀菌半小时，时间一到，关闭紫外灯待用。6. 进入无均室以前，必须于缓冲间更换消毒过的工作服、工作帽及工作鞋。7. 操作应严格按照无菌操作规定进行，操作少说话，不喧哗，以保持环境的无菌状态。六无菌室常用消毒方式及消毒剂1. 紫外线杀菌1）紫外线灯的安装一般悬空吊装在接种室或培养室的上方，吊装紫外灯的个数，应根据房间的大小而定，容 1-2 人操作的接种室，吊装一个 30 瓦的紫外灯就可以了。如果有的接种室或培养室的空间较大，则除悬空吊装紫外灯之外，还可以在房间的不同角度，安装紫外线灯（开关需要设置在杀菌区室外），以达到比较彻底杀菌的目的。2）紫外线灯的作用一般在接

11、种室使用之前，应打开紫外灯，照射约 20-30 分钟，就基本上可以使室内空气和室壁表面上无菌。3）使用紫外线应注意的事项紫外线对物质的穿透很小，对普通玻璃也不能透过，因此，紫外线只能进行空气和室壁表面的杀菌。紫外线对人体皮肤，尤其是对人的眼睛具有杀伤力，所以，不要对着紫外线进行操作，以免眼睛受到伤害。2. 喷洒石炭酸1）常用浓度为 50ml/L 石炭酸（酚）溶液，配制时，可先将盛石炭酸的瓶放在水浴中，使之溶解，再用吸管吸取，配制为50ml/L 的石炭酸溶液。2）喷洒方式最后退出房间，关门，稍等片刻，即可使用，对于较大的房间，以背负式喷雾器较好，以利于房间死角的消毒。3）注意事项石要接触炭酸对于

12、皮肤有很强烈的毒害作用，使用时不皮肤。喷洒石炭酸可以与紫外线杀菌结合使用，这样可增加其杀菌效果。3. 硫磺熏蒸1）用量每立方米空间需用硫磺 3-4g ，熏蒸前，须把硫磺放在金属容器内加热，利用产生的二氧化硫进行熏蒸。熏蒸前需将地面和墙壁撒水少许，以增加灭菌效果，熏蒸完毕，房间需要密封过夜后才能使用。次方法灭菌效果比较好，但比较麻烦。熏蒸时，硫磺蒸汽刺鼻，影响操作和身体健康，应适当注意。二氧化硫对金属器皿有腐蚀性，熏蒸前应把金属器皿事前搬出，以免发生腐蚀。4. 乳酸加热熏蒸4按熏蒸空间计算，以 1ml/m3 的量，量取 80%的乳酸溶液，盛在可加热的容器内，用铁架或其他加热架支好。在酒精灯或酒精

13、炉内加入适量酒精（以能蒸干所有乳酸溶液为宜，不要超过太多）。确认待处理区域内没有生产原料、包装材料、成品 及半成品，以及所有的生产用容器均以有效保护（盖紧或覆盖严密）。关闭所有门窗，以及空调、通风系统。点燃酒精灯或酒精炉，所有人员迅速撤离，关闭出口的门。任乳酸溶液煮沸挥发。酒精灯或酒精炉应能在乳酸蒸发完后即自行熄灭。熏蒸后保持门窗关闭12h 以上，再进行通风，放出剩余有刺激性的气体。通风时间大约需要12h。5. 甲醛加热熏蒸3甲醛使用量为 2-6ml/m ，常用浓度为 36%-40%。6. 甲醛氧化熏蒸1）使用量：按甲醛加热熏蒸所需的用量量取定量的甲醛溶液。按甲醛溶液用量的 1/2 称取高锰酸

14、钾，置于一个非金属容器内。2）使用方式：同乳酸加热熏蒸法，确认处理区域内准备完全后，把甲醛溶液到入盛有高锰酸钾的容器内，人员迅速撤离，关闭出口。在与高锰酸钾作用产热下，甲醛溶液即沸腾挥发。熏蒸后保持门窗关闭 12h 以上，再进行通风，防出剩余有刺激性的气体。通风时间大约需要 12h。七超净工作台工作原理、注意事项工作原理进风经过初、中效过滤器后（中效过滤器金属框架内饶无纺布制成，其过滤对象是 1-10mm的尘埃，使用一段时间后积尘增多阻力增大效率降低要定期修理或更换 ; 高效过滤器金属框架内饶超细玻璃纤维滤纸制成过滤对象为小于1um尘埃，为主要部件）吸入风机，经过风机加压后，经过顶部的高效过滤

15、器过滤的洁净空气垂直送到工作区，然后一部分排至室内，大部分通过台面上的孔回风进行循环。注意事项1） . 超净工作台操作区为垂直层流区，因此出风面操作位置不应置多余的物品，以免防碍气流的正常流动，影响洁净度。2） . 操作人员应穿洁净的工作服，不宜在工作区附近快速行走，避免把工作区外的空气带入操作区，操作时手的动作要尽量减少洁净空气外流。3） . 超净工作台面板上的孔作为回风用，使用时要避免有液体或其它物漏入孔中。4）打开风机后5 分钟可以自净。8无菌操作、注意事项（酒精灯、接种针或环）无菌操作5培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬

16、液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养

17、基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。（图）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。图斜面接种时的无菌操作(1) 接种灭菌 (2) 开启棉塞 (3) 管口灭菌 (4) 挑起菌苔 (5) 接种 (6) 塞好棉塞二、分离纯化含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲

18、代细胞，那么这个菌落称为纯培养（ Pure culture ）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。、倾注平板法6首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。九具体检测项目（步骤、注意事项），接种、培养，1）、菌落总数检样程序检样做成几个适当倍数的稀释液选择 2-3 个适宜稀释度各以1ml 之量加入灭

19、菌平皿中每皿加入适量琼脂48± 2h36±1菌落计数报 告2）大肠菌群检样程序检 样稀 释7不产气大肠菌群阴性报 告革兰氏阳大肠菌群阴性报 告乳糖胆盐发酵管24±2h， 36±1产 气伊红美兰琼脂平板36 ±1， 18-24h革兰氏染乳糖发酵管36±1,24±22222222222h革兰氏阴性产气不产气大肠菌群阴大肠菌群阳报 告报 告3）. 霉菌酵母菌检样程序检 样8做成几个适当倍数的稀释液选择 3 个适宜稀释度各以1ml 之量加入灭菌平皿中每皿加入适量培养基25283-5 天菌落计数报 告4）乳酸菌检验程序检样做成几个适当

20、稀释倍数选择 23 个适当稀释度各以1ml 的量加入灭菌平皿内每皿内加入适量改良TJA 或改良 MC培养基36±1 72 ±3h菌落计数镜检、过氧化氢酶实验报告9涂抹检验方法1、 材料（1）150ml 三角烧瓶（2）75%酒精棉球（3）镊子（4）5cm×5cm的涂抹纸（5）平皿 , 直径为 9cm2、 试剂生理盐水： 8.5g 氯化钠溶于 1000ml 蒸馏水中（如检样用氯消过毒，需加10%硫代硫酸钠以除氯）。高压灭菌：生理盐水 50ml 分装于三角瓶中，涂抹纸置于平皿中，在 121下，高压灭菌 20 分钟。3、 操作步骤3.1 以无菌操作向高压灭菌后的装有涂抹纸

21、的平皿中倒入少量生理盐水，润湿即可。3.2 涂抹前，用酒精棉球将手和镊子擦拭三次，进行彻底消毒。1. 3 涂抹时，用无菌镊子取润湿涂抹纸，平铺在被检测物品的表面（有效面积50 cm2），然后将此涂抹纸放入盐水瓶中，充分润洗纸片。不能及时检测，应暂时置于冰箱中，在于 4 小时内检测。2. 4 细菌总数和大肠菌群检测步骤同前。3.5 报告：细菌总数报告为2大肠菌群报告为2cfu/cmMPN/100 cm。空气净度1. 设备和材料1）生化培养箱， 36±1OC2）天平3）恒温水浴锅， 46±1 OC4）平皿，直径为 9cm5）菌落计数器6）酒精灯7）三角瓶，容量为 300ml8）

22、记号笔2 培养基营养琼脂培养基：按 GB4789.28-94 中 4.7 规定或购买制好的营养琼脂，按说明配制后，分装于 300ml 三角瓶中，高压灭菌 121、 15 分钟。3 方法1）在无菌条件下，将凉至 46的营养琼脂注入平皿约 15ml，并转动平皿使之混匀，营养琼脂凝固后，待用。2）根据采样室面积的大小放置营养琼脂平皿，一般规定：22面积 30m，按对角线位置放置3 个皿；面积 30m，按采样室四个角加中间放置 5 个皿。（放置时应将营养琼脂平皿盖打开，放置15 分钟）3）加盖，翻转平板，置于36± 1的培养箱内培养48±2h，取出计数。（同菌落总数测定的计数方法）

23、4）报告：以 cfu/ 平板进行报告。10十、分离培养（划线）、复发酵，判定平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。图平板划线分离法1. 斜线法 2. 曲线法 3. 方格法 4. 放射法 5. 四格法观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落；深紫黑色，具有金属光泽的菌落。紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。淡紫红色，中心较深的菌

24、落。作革兰氏染色、镜检和证实试验。复发酵判定：产酸产气为阳性十一显微镜原理、注意事项，操作原理显微镜的放大效能是有所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的波长幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能直接用肉眼观察。所以利用减小光波波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为 1，而香柏油的折射率为 1.51，和载玻片的玻璃折射率 1.52 相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载玻片、香柏11油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数

25、的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。注意事项1）使用显微镜时，必须端坐勿将镜台倾斜，以免液体标本的镜油流出。香柏油要洁净聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。2）以天然光为光源时，反光镜用平面，以灯光为光源时，反光镜用凹面。3）将镜片标本置载物台上，用移动器或固定夹固定，先用低倍镜对好光线，然后使用油镜，放大光圈和升高集光器。4）使用油镜时，先在标本上滴一滴香柏油目的在于减少光线通过玻片与物镜间的空气时所引起的散光现象。玻片与载玻片的择光率相近似。5）观察标本时，两眼同时睁开左眼看镜筒，右眼绘图或记录6）油镜用毕先用擦镜纸擦去香柏油，再用擦镜纸蘸

26、1： 1 的乙醇、乙醚混合液擦去香柏油，再用擦镜纸擦去 1：1 的乙醇、乙醚混合液然后将接物镜转成“八”字型，下降镜筒和集光器。关闭电源，将防尘罩盖好。7）显微镜使用时动作要稳准，轻拿轻放，平时置干燥处保存，避免阳光爆晒。十二革兰氏染色，操作染色方法1. 革兰氏染色原理革兰氏染色有各种学说（如化学学说、渗透学说、等电点学说等），但任何一种学说均未能单独圆满地解释革兰氏反应，综合各学说观点，革兰氏染色反应可能与以下各因素有关：1）细菌的细胞壁结构上的差异G+菌细胞壁结构致密，细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低。在乙醇中处理，染料和碘的复合物不容易被乙醇析出，使菌体留有紫色。G- 菌细胞壁结构梳松，肽

27、聚糖含量低，含有大量的脂类物质，乙醇容易渗入而脱色。2）细胞膜渗透性不同+-G菌表面结构内含有核糖核酸镁盐，而 G菌表面结构内不含有核糖核酸镁盐。这种核糖核酸镁盐能强力地与染料的碘复合物结合，不易渗出菌体外，染成紫色。3）等电点学说G+菌的等电点在 PH值 2-3 ，G- 菌的等电点在 PH值 4-5 ，所以在同样 PH值条件下，等电点愈低，则与碱性染料结合力亦愈强，其抵抗脱色的能力亦愈强，所-以不易被脱色，呈紫色。相反， G菌等电点偏高，与碱性染料结合力弱，对脱色抵抗力不强，易被脱色，再染成红色。2. 试剂2.1 结晶紫染色液：12结晶紫1g95%乙醇20ml1%草酸铵水溶液80ml将结晶紫

28、溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2.2 革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300ml.2.3 沙黄复染液0.25g沙黄95%乙醇10ml蒸馏水90ml将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。3. 染色法3.1 涂片的制作：3.1.1 取一张洁净无油脂的载玻片，加上一环生理盐水（如系液体标本或液体培养物可不加盐水）3.1.2 用灭菌的接种环，取菌落（纯培养者可取菌苔）少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。液体培养物直接挑取菌液涂片。3.2 干燥一般在室温中使自然干燥。若须加速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥，

29、但切勿紧靠火焰，以免标本烤焦，不易镜检。3.3 固定3.3.1 目的：使细菌的细胞质凝固，杀死细菌；使菌体与玻片粘附的较牢，防止标本被水冲洗掉；改变菌体对染料的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于脱色。3.3.2 方法：一般均用加热法，即将涂片迅速通过火焰2-3 次，以玻片反面接触皮肤，热而不烫为度。3.4 染色：滴加的染液以覆盖标本为度。3.4.1 初染：滴加结晶紫染色液，作用1min，水洗。3.4.2 助染：革兰氏碘液，作用1min，水洗。3.4.3 脱色：滴加 95%乙醇脱色，约 30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色 10s。3.4.4 复染：滴加复染液，

30、复染1min。水洗，待干，镜检。4. 革兰氏染色过程中应注意的事项接种环接的菌不能太多，防止涂片太厚，不易脱色。5. 结果判定：革兰氏阳性菌为蓝紫色，革兰氏阴性菌为粉红色。13G 菌易扭曲变形，造成鉴别困十三坏包分析注意事项、操作一、启动条件1. 包装无明显破损。2. 由微生物污染引起的坏包。3. 目地样：同一批次，同一取样原因，取坏包表现性状相同的任意12 包进行细菌的培养及初步鉴定。如表现性状不同，针对不同表现性状的坏包分别取 12 包进行细菌的培养及初步鉴定；如不同取样原因，针对取样原因分别取表现性状相同的坏包任意 12 包进行细菌的培养及初步鉴定。4. 随机样：不同时段出现坏包，针对时

31、段分别取表现性状相同的坏包任意12包进行细菌初步鉴定；相同时段出现坏包，针对不同表现性状的坏包分别取 12 包进行细菌初步鉴定。二、 记录样品：名称、批号、取样原因、时间、样品感官、 PH值、酸度、气体形成，包装密封性，微生物鉴定结果等。三、 样品处理准备1. 酸包：检测时发现产品感官及 PH值有明显变化时，需快速将酸包产品的内容物移入无菌容器内（移入时需用 75%的酒精棉对操作员手及开包产品的移出口进行擦试灭菌），并需快速检测。如不能检测，需冷藏保存2 小时内进行检测。2. 胀包：使用 75%酒精棉对样品外表面擦试消毒后放于超净台内待检。检测时，以无菌操作在无横纵封处剪一半圆或三角取样。四、

32、 检测（划线，接种培养）：以无菌操作进行检测1. 细菌：取 1ml 混合均匀的样品接种于培养皿中，及时将凉至 46的营养琼脂注入平皿约 15ml，并转动平皿使之混匀；同时将营养琼脂注入加有 1ml 灭菌生理盐水的平皿内做空白对照；36±1/48 小时条件下培养；另用接种环于营养琼脂平板上作划线培养（36±1/48h ）。2. 芽孢、耐热芽孢：取 5ml 样品于两个小试管（ 15*150）中，分别在 80和100的水浴中保温 10min，冷却。分别取 1ml 样品接种于培养皿中，用普通营养琼脂分别作芽孢（ 36±1/72h ）和耐热芽孢（ 55±1/72h

33、 ）的接种培养；另用接种环于营养琼脂平板上分别作芽孢（ 36± 1 /72h ）和耐热芽孢（ 55± 1/72h ）的划线培养。3. 霉菌、酵母菌：取 1ml 混合均匀的样品接种于培养皿中，用虎红（孟加拉红）琼脂于 2528 /5 天条件下培养；另用接种环于虎红（孟加拉红）琼脂平板上作划线培养（ 2528/5 天）五、初步鉴定：（挑取菌落一一对应）1. 菌落记录：形态、大小、边缘、表面、透明度、隆起度、颜色、气味等。2. 初染：选取不同形态的单一菌落。滴一滴苯胺黑（ 2%水溶液）或结晶紫染液于载玻片上，用接种环挑取少量菌于涂液的载玻片处 , 完全涂匀 . 待自然干燥后 ,

34、滴香柏油 , 使用显微镜的油镜观察 , 主要鉴别球菌、杆菌，微生物不着色，在黑背景处观察清晰、闪亮点。难。3. 细菌形态的鉴定143.1 球菌：对于球菌，不一定需要 G染色，因为 G球菌不会成为液体食品中的腐败菌，可直接进行 H2O2 酶实验。鉴别 H2O2 酶阳性、阴性球菌。+3.2 杆菌：需进行 G染色，鉴别 G 或 G，有无芽孢形成。4.H2O2 酶试验：是一个裂解 H2O2，产生 O2 的过程。鉴别 H2O2 酶试验阴性或阳性的 G+杆菌。4.1 方法：滴一滴 10%的 H2O2 酶溶液于载玻片上，使用接种环挑取与菌落形态、初染、 G染色均对应的菌落（少量），于涂有 H2 O2 的载玻

35、片，完全涂开观察。4.2 结果：有气体生成 H2O2 酶阳性；无气体生成 H2O2 酶阴性。5. 氧化酶试验：鉴别氧化酶试验阳性、阴性的G 杆菌。5.1 方法：取一试纸条，使用接种环挑取少量相对应的菌落涂于氧化酶试纸条有药品的一端，观察。5.2 结果：不变色氧化酶阴性变色氧化酶阳性6. 检测范围、项目：6.1 低酸产品：检测细菌、芽孢、耐热芽孢，必要时检测霉菌、酵母菌。6.2 高酸产品：检测细菌、霉菌、酵母菌。菌落形态 细菌a. 大小： <1mm为露滴状菌落 ,1-2mm 为小菌落 ,2-4mm 为中等小菌落 ,4-6mm大菌落 ,>6mm为巨大菌落。b. 形态：圆形、不规则状，假根状等。c. 隆起度：扩展，台状、低凸状、乳头状等。d. 菌落边缘：边缘