大规模细胞培养及发酵技术ppt课件

1、 动物细胞的特点：动物细胞的特点： 无细胞壁无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢倍增时间长，生长缓慢 需氧量少，对搅拌敏感需氧量少，对搅拌敏感 聚集体构成聚集体构成 原代细胞培育原代细胞培育50代即开场退化代即开场退化 动物细胞培育的定义：动物细胞与动物细胞培育的定义：动物细胞与组织培育是从动物体内取出细胞或组织培育是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温暖丰富的营养条件下，使菌、适温暖丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维离体细胞或者组织生存、生长并维持构造和功能的一门技术持构造和功能的一门技术 生长特性生长特性 贴壁生长型：如人胚肺细

2、胞，贴壁生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞细胞，巨噬细胞，神经细胞 悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴细胞等细胞等 体外培育特点体外培育特点 体外培育工具体外培育工具 体外培育条件体外培育条件 体外细胞生长增殖过程体外细胞生长增殖过程 培育方法培育方法 大规模培育技术大规模培育技术 营养条件苛刻营养条件苛刻 顺应性差，敏感顺应性差，敏感 培育时间长，易污染培育时间长，易污染 温度，温度，37 pH：7.2-7.4 气体：氧，二氧化碳，氮气气体：氧，二氧化碳，氮气 营养条件：需求多种氨基酸，维生素，营养条件：需求多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，

3、嘧啶，激素和生长辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可由血清提供因子，其中多种成分可由血清提供 反响器贴壁培育反响器贴壁培育 容易换液，不需特殊的分别细胞和培育容易换液，不需特殊的分别细胞和培育液的设备，可采用灌流培育获得高密度液的设备，可采用灌流培育获得高密度，但扩展规模较难，适宜制备量小，价，但扩展规模较难，适宜制备量小，价值高的生物药品。值高的生物药品。CelliGen PlusTM 微载体培育微载体培育 最有出路的动物细胞大规模培育技术，最有出路的动物细胞大规模培育技术，兼有悬浮培育和贴壁培育的优点，易于兼有悬浮培育和贴壁培育的优点，易于放大。放大。Cytodex，Cy

4、topore和和Cytoline 无血清悬浮培育无血清悬浮培育 用知人源或动物来源的蛋白或激素替代用知人源或动物来源的蛋白或激素替代动物血清的一种细胞培育技术动物血清的一种细胞培育技术 pH 溶氧溶氧 温度温度 谷氨酸谷氨酸/谷氨酰胺谷氨酰胺 葡萄糖葡萄糖 乳酸乳酸 CO2 NH4+ K+/Na+ Ca+ 浸透压浸透压 细胞密度细胞密度 细胞凋亡细胞凋亡 细胞在高密度条件下，由于细胞的细胞在高密度条件下，由于细胞的多层生长，存在细胞接触抑制效应多层生长，存在细胞接触抑制效应，细胞的生长和表达均遭到严重影，细胞的生长和表达均遭到严重影响响 细胞凋亡主要是细胞生长的条件较恶劣细胞凋亡主要是细胞生长

5、的条件较恶劣，包括：，包括： 1.营养缺乏营养缺乏 2.有害代谢产物的积累有害代谢产物的积累 3.pH和溶氧控制不当和溶氧控制不当 4.机械搅拌剪切力较大机械搅拌剪切力较大 5.浸透压浸透压 消费疫苗消费疫苗 蛋白质和多肽药物蛋白质和多肽药物 基因治疗基因治疗 单抗单抗概述概述传统：酿酒、抗生素、制醋传统：酿酒、抗生素、制醋基因工程：消费蛋白质药物、疫苗等基因工程：消费蛋白质药物、疫苗等大肠杆菌、酵母大肠杆菌、酵母普通采用高密度发酵技术普通采用高密度发酵技术培育过程决议于：培育过程决议于：菌种菌种培育条件培育条件微生物培育过程重要参数：微生物培育过程重要参数：温度温度pH溶氧溶氧葡萄糖葡萄糖/

6、甘油甘油乙酸乙酸 乳酸乳酸 NH4+ 磷酸盐磷酸盐 乙醇乙醇(酵母酵母) 甲醇甲醇(酵母酵母) 细胞密度细胞密度发酵培育基发酵培育基表达基因的调控表达基因的调控宿主菌宿主菌质粒的拷贝数及稳定性质粒的拷贝数及稳定性高密度培育的关键是发酵的补料控制高密度培育的关键是发酵的补料控制,根据根据重组菌的生长特点及产物的表达方式采重组菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养物质的流加方式取合理的营养物质的流加方式恒速流加恒速流加变速流加变速流加指数流加指数流加微生物高密度培育乙酸的构成微生物高密度培育乙酸的构成:培育液中葡培育液中葡萄糖的含量超越菌体生长所需量或在缺氧萄糖的含量超越菌体生长所需量或在缺氧

7、的情况下的情况下,便会大量产生乙酸便会大量产生乙酸.减少乙酸的战略减少乙酸的战略:限制性流加葡萄糖限制性流加葡萄糖甘油替代葡萄糖甘油替代葡萄糖降低培育温度降低培育温度 宿主菌宿主菌 降低比生长速率降低比生长速率 透析培育透析培育了解生物技术的运用了解生物技术的运用不同的细胞具有不同最正确 pH范围pH 能影响葡萄糖和谷氨酰胺的代谢，在低pH条件下，葡萄糖耗费速度慢pH能影响细胞的生长和目的产物的量Effects of pH on IgGProduction0102030406.877.2 7.4 7.6pH Unitslog H+ 在细胞培育过程中，在细胞培育过程中，CO2 与碳酸氢盐构成缓冲

8、对，稳定培育与碳酸氢盐构成缓冲对，稳定培育液中的液中的 pH CO2也可用于计算呼吸商，反响细胞活力和代谢旺盛程度也可用于计算呼吸商，反响细胞活力和代谢旺盛程度 细胞代谢呼吸作用会产生细胞代谢呼吸作用会产生CO2 (废物废物) CO2 程度添加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目的蛋程度添加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目的蛋白的表达，当溶液中白的表达，当溶液中CO2到达到达14-15%时，会严重抑制细胞的时，会严重抑制细胞的生长生长CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-葡萄糖等需氧来氧化产生ATP供细胞的能量用于丈量和跟踪细胞耗费氧的速率.Oxygen Consumptio

9、n Rate of Cells inCulture00.10.20.31015202530354045Time (min)O2:mmol/L 在细胞培育和发酵过程中，在细胞培育和发酵过程中，O2 通常是限制营养成分，是由通常是限制营养成分，是由于它在溶液中低溶解度于它在溶液中低溶解度: 通常关怀对培育液中通常关怀对培育液中 % O2, 也就是也就是“溶氧溶氧 值值 (DO): 实际实际DO: 80% +/- 5 % (哺乳动物细胞培育哺乳动物细胞培育) 90 % DO2 (细菌培育细菌培育 O2 也能够经过自在基构成对细胞呵斥损伤也能够经过自在基构成对细胞呵斥损伤,在低在低pO2 程度，程度，

10、细胞的活性通常越高细胞的活性通常越高 (O2 值必需维持在最低的程度值必需维持在最低的程度) 然而然而, 原代细胞能够在低原代细胞能够在低 O2 条件下繁衍受延迟条件下繁衍受延迟 因此，维持正确的因此，维持正确的O2的平衡，对保证一切细胞正确生长的平衡，对保证一切细胞正确生长都非常重要都非常重要,普通普通30-50%葡萄糖两个主要的功能:细胞的主要的能量物质主要的细胞碳源葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充的:产生其他代谢物 (例如: 天冬氨酸)提供能量在一切细胞中经过糖酵解途径转变成丙酮.葡萄糖的代谢随细胞生长而添加. 葡萄糖通常是细胞生长的限制要素Gluc & Cell Density vs Tim

11、e in Batch Culture012345601530456075808590Time (min)Gluc (mmol)00.511.52Cell Count (cells/ml) 监控细胞反响器和发酵罐中的葡萄糖程度监控细胞反响器和发酵罐中的葡萄糖程度: 保证细胞正常生长所需能量保证细胞正常生长所需能量. 开发延伸细胞培育周期的规范补料战略开发延伸细胞培育周期的规范补料战略. 计算葡萄糖耗费速率和决议批次培育最正确的起始浓度计算葡萄糖耗费速率和决议批次培育最正确的起始浓度.在培育过程中，大多数乳酸来自于葡萄糖代谢，但也有一部分来自于谷氨酰胺代谢.基于高细胞密度和深液位，氧的耗费非常大.

12、典型的范围 (组织培育): 0 - 5 g/LO2 耗费导致乳酸的构成，最终导致pH的下降. 对恒定的 pH:抑制细胞生长的乳酸程度在低到 4 mM 到高达 70 mM (取决于细胞).在大多数情况下，铵对细胞生长的抑制比乳酸更严重.Gluc & Lact in Batch Culture05101520250123456Time (days)Gluc/Lact mMLactGluc 监控长时间细胞培育中乳酸的积累监控长时间细胞培育中乳酸的积累. 计算乳酸产量与葡萄糖的耗费之间的代谢关系计算乳酸产量与葡萄糖的耗费之间的代谢关系 调查乳酸盐对细胞表达产物的毒害影响调查乳酸盐对细胞表达产物的毒害影

13、响细胞培育和发酵中铵的来源:主要来源: 代谢谷氨酰胺(谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸其他氨基酸的脱氨基作用铵的程度也取决于细胞密度和细胞代谢方式.引起细胞抑制的铵离子浓度范围: 从:0.5 mM (L Mouse Cells)到:40.0 mM (M. Ascites Tumor Cells)(不同的细胞株对铵有不同的耐受度)Cell Counts vs Ammonia Levels OverTime0501001502002503003504004505001234567Time (min)Cell Density (cells/ml)012345678Ammonia (mM)C

14、.D.NH3pH 会受会受 NH3添加的影响添加的影响:NH4+ NH3 + H + 铵的添加也会改动细胞内蛋白质的运动铵的添加也会改动细胞内蛋白质的运动.监控发酵监控发酵罐和生物反响器中铵的程度废物罐和生物反响器中铵的程度废物.推算谷胺酰胺的降解程度推算谷胺酰胺的降解程度.调查铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响调查铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响.监控引入培育基的质量监控引入培育基的质量. 添加换液的速率添加换液的速率 ( (补料补料).). 维持培育液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解维持培育液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解. . 在低的在低的 pH pH培育减少培育减少NH3NH3构成

15、构成. . 去除培育液中的铵去除培育液中的铵: : 酶转化酶转化 经过特殊的经过特殊的 “PTFEPTFE 膜将膜将 NH3 NH3 分散到低分散到低pH pH 溶液中溶液中 运用可以逐渐接受高运用可以逐渐接受高 NH3 NH3 浓度的细胞浓度的细胞 与葡萄糖一样与葡萄糖一样, , 谷氨酰胺也是细胞的主要物质谷氨酰胺也是细胞的主要物质: :* * 碳和氮碳和氮* * 能量能量 谷氨酰胺通常被以为是细胞培育的主要限制营养谷氨酰胺通常被以为是细胞培育的主要限制营养 谷氨酰胺是生物合成的前体物质谷氨酰胺是生物合成的前体物质: : * * 嘌呤嘌呤* * 嘌呤核苷嘌呤核苷 谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和

16、天冬的主要氨基受体谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体 监控谷氨酰胺的程度监控谷氨酰胺的程度: 确保细胞生长所需的能量确保细胞生长所需的能量. 开发长时间细胞培育规范化补料战略开发长时间细胞培育规范化补料战略. 计算谷氨酰胺的耗费速率和决议批次培育最正确的其计算谷氨酰胺的耗费速率和决议批次培育最正确的其始浓度始浓度. 需用来计算谷氨酰胺需用来计算谷氨酰胺 需确证谷氨酸需确证谷氨酸 的浓度，确保没加进谷的浓度，确保没加进谷氨酰胺结果氨酰胺结果. 谷氨酰胺的降解产物谷氨酰胺的降解产物Na-K:对适宜培育基消费很重要对适宜培育基消费很重要.维持溶液维持溶液/培育基适宜的离子强度培育基适宜的离子强度. 浸透压是溶液浓度的一个反响浸透压是溶液浓度的一个反响: : 测定浸透压的参考方法是运用浸透压计测定浸透压的参考方法是运用浸透压计 典型细胞培育液浸透压值典型细胞培育液浸透压值: :300 +/-30 mOsmol/kg.300 +/-30 mOsmol/kg. 浸透压升高浸透压升高 50-100 m