疟原虫检验技术

1、疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术 湖南省耒阳市疾控中心 主讲人：郑慧 什么是疟原虫疟原虫疟原虫属是一类单细胞、寄生性的原生疟原虫属是一类单细胞、寄生性的原生动物。本属生物通称为疟原虫。感染人动物。本属生物通称为疟原虫。感染人疟原虫的有四类，包括恶性疟原虫、间疟原虫的有四类，包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫及三日疟原虫。日疟原虫、卵形疟原虫及三日疟原虫。而其他种类的疟原虫会感染它种动物，而其他种类的疟原虫会感染它种动物，包括其他灵长目动物、啮齿目动物、鸟包括其他灵长目动物、啮齿目动物、鸟类及爬虫类。类及爬虫类。疟原虫生活史：疟原虫生活史：在人体内发育：分为红细胞外期和红细胞内期在蚊体内发育：分

2、为配子生殖和孢子增殖分子生物学、血清学技术发展迅猛分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是但是确诊确诊疟疾的疟疾的“金标准金标准” 仍然是血液显微仍然是血液显微镜检查镜检查显微镜检查是唯一可鉴别显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方种疟原虫的方法法厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准的疟疾诊断的金标准实验室技术实验室技术厚薄血膜的制作厚薄血膜的制作 镜检技术镜检技术血片制作血片制作制作血片前，首先要准备两块干净的玻片及制作血片前，首先要准备两块干净的玻片及核对患者的姓名和年龄。核对患者的姓名和年龄。并在玻片上做好标记如：姓名并在玻片上做好标记如：姓名

3、 年龄年龄取血部位和血量取血部位和血量 取血方法取血方法 采血部位：采血部位：耳耳垂或无名指，通常在耳垂垂或无名指，通常在耳垂取血，先用取血，先用75%75%酒精棉球酒精棉球消毒取血部位，待酒精干消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米血。厚血膜血量约一粒米大小。大小。厚血膜厚血膜 用毛细管取约用毛细管取约4微升血量（相当于火柴头大微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与

4、平置的玻片接触，再用另一玻片小），使血滴与平置的玻片接触，再用另一玻片一角与血滴接触由里向外一个方向旋转，转一角与血滴接触由里向外一个方向旋转，转24圈，圈，涂成直径涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜。厘米大小圆形厚血膜。薄血膜薄血膜再取一小滴血再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方当远的地方.用另一玻片用另一玻片(推片推片)的边缘紧贴载玻片使的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开血液沿边缘散开(如图示如图示).正确的推片姿势正确的推片姿势标准的疟疾厚薄血膜片位置标准的疟疾厚薄血膜片位置各种不同的疟疾血片涂制法：各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片标准血片

5、门诊发热病人血片门诊发热病人血片居民普查血片居民普查血片厚薄血膜的标准厚薄血膜的标准 厚血膜血量适宜，不宜过多或过少厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 薄薄血膜平整血膜平整,无皱折和空泡无皱折和空泡.红细胞单层排列红细胞单层排列染色前血模的固定与溶血 血膜制成后，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血血膜制成后，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。薄血膜在染色前须经甲醇膜自然干燥后才能染色。薄血膜在染色前须经甲醇固定：滴加甲醇覆盖薄血膜约一分钟，然后用清水固定：滴加甲醇覆盖薄血膜约一分钟，然后用清水冲去甲醇残液，让固定后的薄血膜自然干燥即可。冲去甲醇残液，让固定后的薄血膜自然干燥即可。

6、甲醇不可接触到厚血膜。而厚血膜在染色前必须溶甲醇不可接触到厚血膜。而厚血膜在染色前必须溶血：准备一个小烧杯（盛水容器），盛蒸馏水或过血：准备一个小烧杯（盛水容器），盛蒸馏水或过滤后的冷开水，液体高度不能接触到薄血膜；将玻滤后的冷开水，液体高度不能接触到薄血膜；将玻片上干燥后的厚血膜浸入水中约三到五分钟，看厚片上干燥后的厚血膜浸入水中约三到五分钟，看厚血膜的血色全部消褪后即可将取出玻片自然干燥。血膜的血色全部消褪后即可将取出玻片自然干燥。血膜的保存 血膜放置时间，夏天不宜超过血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，小时，冬天不宜超过冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自小时，否则厚血膜会自然固膜，可先

7、用甲醇固定薄血膜，将厚然固膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中置室温中12小时后取出血片小时后取出血片吉氏染液吉氏染液(原液原液)的配置的配置 吉氏染粉吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油甘油 (纯纯) 250ml 甲醇甲醇 (纯纯) 250ml 吉氏染粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨吉氏染粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研

8、钵中加入研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤经过滤即可使用。保即可使用。保存时间越长染色效果越好。存时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于整个染色液配制时间不能少于5个小时个小时稀释吉氏原液稀释吉氏原液原液需经蒸馏水或净水稀释后，方可原液需经蒸馏水或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。用于厚薄血片染色。 吸取母液时，不要晃动瓶子吸取母

9、液时，不要晃动瓶子,以免沉淀以免沉淀物泛起影响染色效果物泛起影响染色效果.操作操作1 （快染）（快染） 量筒内量量筒内量2ml蒸馏水或净水，蒸馏水或净水，直接滴加吉氏原液直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，清水细缓冲洗，晾干镜检。晾干镜检。操作操作2 (慢染慢染) 量筒内量量筒内量2ml蒸馏水或净水，蒸馏水或净水， 再滴加吉氏原液再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，滴，混匀，滴入待染标本上，染色染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。清水细缓冲洗，晾干镜检。吉氏染液浓度吉氏染液浓度门诊染色门诊染色

10、将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染吉氏染液稀释液（液稀释液（3毫升吉氏原液加毫升吉氏原液加蒸馏水或净水蒸馏水或净水97毫升，毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色2030min（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 成批血片染色成批血片染色质量好的染色质量好的染色 : 显微镜下核呈红色显微

11、镜下核呈红色,胞浆呈蓝色胞浆呈蓝色 如果血片偏红如果血片偏红,说明染液偏酸性，说明染液偏酸性， 如果血片偏蓝如果血片偏蓝,说明染液偏碱性，说明染液偏碱性，外观吉氏染色血片外观吉氏染色血片偏偏 酸酸偏偏 碱碱标标 准准血片制作注意事项血片制作注意事项 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果结果 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜 血片充分干燥后染色，血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚血膜清水细缓冲洗。防止厚血膜脱落脱落. 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜配置吉氏母液必须过滤

12、除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量检质量 影响血膜染色质量的因素影响血膜染色质量的因素 血片染色好坏，除与玻片的清洁程度。血膜制作的质血片染色好坏，除与玻片的清洁程度。血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关：量和染色技术等有关外，还与下列因素有关：染液的新旧：新配制的染液，一般染色礼较弱，且常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前12周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量。染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，染色浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀清晰，染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果.染色时间：染色时间长

13、，染色效果好，反之则差。染色时间长短与温度有关，温度高着色快，故染色时间可适当的缩短，温度低染色慢，则时间可适当的延长。 四种疟原虫的四种疟原虫的 形态特征形态特征 红细胞不涨大红细胞不涨大环状体钎细环状体钎细, 一个红一个红细胞内可有几个环细胞内可有几个环状体状体,环状体内可有环状体内可有2个核个核 环状体可贴在红细环状体可贴在红细胞边缘胞边缘 血片中没有其他发血片中没有其他发育期滋养体育期滋养体 配子体呈新月形或配子体呈新月形或腊肠形腊肠形成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含6-32个裂殖子个裂殖子可出现茂氏点可出现茂氏点恶性疟（恶性疟（P.falciparum）鉴定）鉴定 要点要点红细胞通常涨红

14、细胞通常涨大大 薛氏点明显薛氏点明显 成熟环状体粗成熟环状体粗大大滋养体胞浆有滋养体胞浆有阿米巴样伪足阿米巴样伪足血片中可见各血片中可见各期的原虫形态期的原虫形态成熟裂殖体约成熟裂殖体约含含12-24个裂殖个裂殖子子 间日疟（间日疟（P. vivax ）鉴定要点）鉴定要点红细胞不红细胞不涨大或略涨大或略小小环状体可环状体可呈方形呈方形胞浆不活胞浆不活跃呈带状跃呈带状形形 成熟滋养成熟滋养体呈菊花体呈菊花状状,内含内含6-12个裂殖个裂殖子子 核可能出核可能出现在环状现在环状体边缘体边缘 三日疟（三日疟（P.malariae）诊断要点）诊断要点卵形疟（卵形疟（P. ovale）诊断要点）诊断要点

15、红细胞涨大红细胞涨大 常见慧星状常见慧星状 (也称齿轮状也称齿轮状)环粗大环粗大 薛氏点明显薛氏点明显 成熟滋养体类成熟滋养体类似三日疟原虫似三日疟原虫但更粗大但更粗大成熟裂殖体约成熟裂殖体约含含4-12个裂殖个裂殖子子 种种周 围 血周 围 血中 发 育中 发 育阶段阶段红细胞形态红细胞形态疟原虫形态疟原虫形态大小大小点彩点彩胞浆胞浆疟色素疟色素裂殖子数裂殖子数恶性疟原恶性疟原虫虫环状体环状体配子体配子体正常正常常见常见茂氏茂氏点点环状体钎细，环状体钎细，常见个核常见个核粗黑，配子粗黑，配子体中明显体中明显6-32平均平均 = 10-24间日间日疟原疟原虫虫各 期 滋各 期 滋养体养体裂 殖

16、 体裂 殖 体和和配子体配子体涨大涨大,可达正可达正常的常的 1.5-2 倍倍薛氏薛氏点可点可出现出现阿米巴样滋养阿米巴样滋养体，浅蓝色，体，浅蓝色，活泼活泼金棕色金棕色不明显不明显12-24平均平均 = 16卵形卵形疟原疟原虫虫各期滋各期滋养体养体裂殖体裂殖体涨大涨大,可达正可达正常的常的 1.25-1.5倍倍薛氏薛氏点可点可出现出现卵圆形滋养体，卵圆形滋养体，蓝色较深，核蓝色较深，核较大较大深棕色深棕色明显明显4-12平均平均 = 8三日三日疟原疟原虫虫各期滋各期滋养体养体裂殖体裂殖体和和配子体配子体正常正常西门西门氏点氏点少见少见圆形，蓝色深，圆形，蓝色深，核紧缩，滋养核紧缩，滋养体带状

17、体带状深棕色，粗深棕色，粗明显明显6-12平 均平 均 = 8呈菊花状呈菊花状镜检示教镜检示教以下血片采自现症病例以下血片采自现症病例这是一块这是一块27岁女背包客的薄片，她最近徒步穿越了泰国北部岁女背包客的薄片，她最近徒步穿越了泰国北部并出现了高烧现象并出现了高烧现象一个典型的恶性疟原虫介绍一个典型的恶性疟原虫介绍许多细环形式 双染色点 边缘形式红细胞不扩大薄膜是从一个薄膜是从一个22岁的男性取得，他一个月以前曾经去龙目岛（印度岁的男性取得，他一个月以前曾经去龙目岛（印度尼西亚）度假。返回后出现间歇性发烧。尼西亚）度假。返回后出现间歇性发烧。一个典型的间日疟原虫介绍一个典型的间日疟原虫介绍突

18、出的特点: 发展和厚（纹章）环形式 扩大红细胞最近在非洲旅行。来源不明的发热。一个典型的卵形疟原虫介绍一个典型的卵形疟原虫介绍发展形式的疟原虫彗星“红细胞 扩大红细胞女性病人，女性病人， 2周以前从巴西回来。回来后类似流感的症状周以前从巴西回来。回来后类似流感的症状一个典型的疟原虫疟原虫介绍一个典型的疟原虫疟原虫介绍宽带形式疟原虫红细胞不扩大这个厚膜从一个这个厚膜从一个32岁的男性身上取得，他最近从越南回来岁的男性身上取得，他最近从越南回来 许多环形疟原虫可以看到（如所指出的箭头）。许多环形疟原虫可以看到（如所指出的箭头）。 注意尺寸的中性粒细胞（比较）。注意尺寸的中性粒细胞（比较）。The

19、only definitive diagnosis that can be made from this film is that Malaria is present. Thin films would have to be examined for species identification.读片练习读片练习2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. 3. History of round the world safari including S. America, Asia and Africa. General malaise. 4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C 5. Male recently return