乙型肝炎病毒基因组变异研究的几个热点问题

1、乙型肝炎病毒基因组变异研究的几个热点问题nbsp;nbsp;nbsp;侯金林nbsp;nbsp;孙nbsp;nbsp;剑nbsp;nbsp;骆抗先nbsp;nbsp;广州第一军医大学南方医院nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;对乙型肝炎病毒(HBV)基因变异已进行了较为系统的研究，然而，仍有许多问题尚未解决。比如，HBV变异对临床的影响到底有多大?新近认为几 侯金林孙剑骆抗先广州第一军医大学南方医院对乙型肝炎病毒(HBV)基因变异已进行了较为系统的研究，然而，仍有许多问题尚未解决。比如，HBV变异对临床的影响到底有多大?新近认为几种类型的HBV变异株可能与临床抗病毒治疗有关：一些报告认为H

2、BV前C和C基因以及C基因启动于变异可能与干扰素治疗应答有关：而研究发现HBVP基因活性部位的变异可导致核苷类似物治疗中的耐药。这些问题已成为临床医生关注的焦点。一、乙型肝炎病毒血清型和基因型(一)概述乙型肝炎病毒亚型有aywl、ayw2、ayw3、ayw4、adw2、adw4、ayr、adrq+及adrq九种，已发现的HBV基因型有AH八种。研究HBV亚型与基因型的关系表明(见表1)，不同的亚型可属同一基因型，而同一亚型又可分布于不同基因型。亚型并不能反映基因组的异质性。基因型概念的提出建立在测序的基础上，故测序成为主要的鉴定基因型的方法。表IHBV亚型和基因型的关系HBV基因型HBV亚型A

3、型adw2和adwlB型adw2和aywlC型adr、ayr和adw2D型ayw2和ayw3E型ayw4F型adw4、ayw4和adw2G型adw2H型adw3基因型是指根据不同个体基因序列之间的规律性差异而分成的不同类型，它用来描述基因本身的特征。基因型分析可鉴定个体或病毒毒株之间的差异。以往根据HBV外膜生蛋白第122-134位氨基酸(dy决定簇)、第139-147位氨基酸(a决定簇)以及第159-160位氨基酸(wr决定簇)的变化，将HBV毒株分为四个主要血清亚型：adw、adr、ayw和ayr。基因序列的单个核酸的变化即可能改变血清亚型，放血清亚型不能反映基因的差异。根据HBV全基因序

4、列异质性=8的界线，可将其分为不同的基因型。目前，已鉴定的HBV基因型有AH八种，基因型与血清亚型之间的关系已被清晰论证。Ohba等通过对HBV全序列分析发现，在不同基因型之间S区段异质性最大，而型内S区段的异质性最小，从而可以根据S区基因序列异质性=4的标准代替全序列进行基因分型。在此基础上，发展了一系列简单、准确的分型方法，推动了HBV基因型的流行病学及临床相关研究。HBV基因型的分布具有明显的地理学特点，大体上如下：基因型A主要流行于美国及北欧国家；基因型B和C主要分布在亚洲及远东地区；基因型D在世界各地均有发现,但主要分布于地中海地区；基因型E仅限于非洲；基因型F则分布在中美洲；刚鉴定

5、不久的基因型G和H的地理分布尚不清楚。(二)HBV基因型与病毒变异病毒变异是指基因型以外的序列改变，而基因型也是在漫长的岁月中变异积累形成的。可以推测，乙型肝炎病毒的某些变异位点与病毒基因型相关，许多相关研究也证明了这一点。Magnius等认为，基因型E、F在第140位氨基酸为丝氨酸特异替代，影响“a”决定簇区结构的稳定性，可能会导致第141位的赖氨酸变异为谷氨酸，使表面抗原的特性发生改变，产生免疫逃逸现象。前C区1896变异是基因型依赖的，在B、C、D和E型的G1896与T1858配对的干襻结构不稳定，1896的GA变异使干襻结构趋于稳定，故前C终码变异率较高。而A和F型的1858位核苷酸为

6、C，能与1896位核苷酸C形成稳定的结构，较少发生变异。所以，前C区1896变异的流行率与基因型相关，这就造成HBeAg阴性HBV感染流行率与地区优势基因型相关的现象，这一观点已被广泛论证。C基因启动于(CP区)变异也与基因型相关。Chan等观察了45名慢性肝炎患者，发现1858位核着酸为C的基因型(A、F基因型)较1858位核苷酸为T的基因型(B、C、D、E基因型)更易出现CP区变异。Orito等对50名HBVB和C基因型感染的病人研究发现，C基因型中CP区A1762T、G1764A双突变发生率(58)显著高于B基因型(16)。不同的基因型与某些变异相关，可能是不同基因型HBV感染后疾病表现

7、差异的分子生物学基础，也可能影响着病毒对疫苗和药物的反应。过去的研究提示，乙型肝炎病毒基因的变异可能会影响e抗原阳性慢性肝炎病人对a干扰素的应答，已进行研究的HBV基因区段包括A1896终码突变、C基因启动子变异及C基因变异。(三)HBV基因型与临床结局乙型肝炎病毒主要通过宿主免疫机制引起肝脏损害，免疫应答的主要目标是HBcAg，由HLA工限制的CDS+T细胞识别并攻击受感染的肝细胞引起炎症，这个过程受包括宿主、病毒的多个因素影响。病毒基因异质性影响着抗原的表达，可能也从中扮演了重要的角色。较早时期，Shiina等研究了血清亚型与疾病表现之间的关系，在对1744名HBcAg携带者的调查发现，a

8、dr亚型(C基因型)较adw亚型(主要为B基因型)更易出现肝脏病变，提示HBV血清亚型或基因型在对宿主的致病性存在差异。Mayerat等比较了35例急性肝炎及30例慢性肝炎病人中的基因型分布，发现在慢性肝炎组中，A型占80(2835)，D型占11(435)；因急性肝炎组，D型占80(2430)，A型占10(330)。研究显示基因型A与慢性肝炎相关，基因型D与急性发病相关，提示病毒基因型在病毒宿主相互作用中有一定差异，这可能是因为基因型A所产生的抗原性要弱于基因型D，诱导机体产生免疫清除的能力也较弱，导致感染迁延。Lindh等对东亚地区的43名基因型为B和C的HBV慢性感染者的基因型及CP变异的

9、研究表明，T1762变异更易出现在C基因型，感染C型后更易出现较重的肝脏炎症。Kao等在台湾做了一较大样本的调查，用分子生物学方法鉴定100名无症状携带者及170名慢性肝病和肝癌病人中的基因型分布，发现C基因型在肝硬化及年龄大于50岁的病人中的流行率显著高于无症状携带者；年龄分层分析显示，35岁以下的肝癌病人中B型的感染率远远高于无症状携带者；另外，C基因型感染率随年龄的增长而下降。结果提示C基因型要经过较长时间的免疫清除然后进入较严重的肝脏损害阶段，而B基因型则经过较短的免疫清除进入较轻的病变阶段。此外，在与肝癌的关系中，C基因型与5b岁以上的肝癌相关，而B基因型则与年轻的肝癌相关，具体的机

10、制尚不清楚。Tsubota等也发现在45岁以上肝硬化病人中，C基因型感染者的肝癌发生率要显著高于B基因型感染者。来自上海的一份研究报告也显示：感染HBVC基因型更倾向于较重的肝病和较大年龄的病人，感染B基因型则倾向较好的病变结局。由于病毒的基因控制着抗原的表达，不同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱。从目前的研究来看，HBVC基因型与较重的肝脏病变相关，B型则与较轻的病变相关；A型与慢性肝炎相关，D型与急性自限型肝炎相关；其它基因型与疾病谱的关系还未有特殊发现。但是，由于基因型分布的不均衡和样本大小的影响，还需

11、要作多中心大样本的研究方能进一步了解基因型与疾病谱之间的关系。(四)HBV基因型与临床治疗感染不同的HBV基因型患者对临床治疗的药物反应可能也不一致。这提示基因的本身影响着病毒对药物的反应。丙型病毒性肝炎的研究发现，在对干扰素的应答中，HCV1型病毒最不敏感，治疗时间要长于其它基因型。随着长效干扰素的临床应用和不同联合抗病毒治疗方案的推出和优化，乙型肝炎病毒(HBV)分子病毒学的特点与抗病毒治疗的关系可能越来越引起临床医生的关注。HBV共分为AH七种基因型，不同的基因型具有不同的变异特点和地域分布特点，但不同的基因型的分子病毒学特点及对干扰素的应答情况并不明确。侯金林等对148例接受干扰素治疗

12、的e抗原阳性的慢性乙肝病人(其中103例来自欧洲16个中心、45例来自中国广州)进行分析，研究了干扰素。治疗结局与HBV病毒学特点之间的关系，包括病毒基因型、引起e抗原表达水平下降的变异(前C和CP区)、C基因变异等。发现在欧洲病人中，最常见的基因型为A和D(A占45，D占34)。A基因型与非A基因型相比，A基因型对标准干扰素治疗应答较好(p=0014)。多因素回归分析发现，与基线HBVDNA和ALT水平相比，基因型A可作为更好的预测治疗应答的指标(p：0001；相对危险度619，95置信区间194198)。相反，对尺疗程的干扰素治疗应答率在不同的基因型中没有差别。对基线和治疗结束时HBV序列

13、研究发现，只有A基因型在治疗结束时CP变异率增高(P0001)。此外，与B、C或D基因型相比，C基因的氨基酶突变率在A基因型中发生率最低。HBV基因型A对标准干扰素治疗应答率较其他基因型高，这与不同基因型的分子病毒学特点有关。感染不同基因型的HBV患者接受干扰素治疗的合理疗程也应不同。二、乙型肝炎病毒P基因变异与临床1P基因结构与功能：1996年在临床应用拉咪呋定治疗的病例中首先发现HBV耐药毒株的存在。目前认为HBV核苷类似物耐药与HBV聚合酶基因变异有关，HBV多聚酶基因编码末端蛋白、间隔区、反转录酶和RNA酶H。过去P基因氨基酸的命名是以P基因的起始密码子开始，但由于不同的基因型P基因编

14、码的氨基酸长度不一致，导致HBVP基因氨基酸的命名一直较为混乱。如基因型A的P基因编码845个氨基酸，而基因型B和C的P基因编码843个氨基酸，D基因型的P基因编码842个氨基酸。这样就导致了同一个氨基酸在不同的基因型中命名位置不一致。如YMDD中的M，在A基因型中命名为552，而B和C基因型中为550，D基因型为539，E和C基因型为549。这种命名的混乱导致不同的文献报道结果不一致，不利于学者之间的交流。为了消除这种基因型之间的差异，最近有学者重新对P基因进行了命名，命名原规则如下：不同的HBV毒株P基因TP(末端蛋白)和间隔区在不同基因型中长度不一致，而所有HBV毒株的RT长度均为344

15、个氨基酸并起始于一个保守序列EDWGPCDEHG。基于这样一个特点，对P基因CT区进行单独命名。根据HIV研究的经验，将HBVP基因的RT(逆转录酶)区分为AF六个区，目前已发现的耐药株中P基因变异是多位点的，可伴于AE五个区中存在，还未发现F区耐药变异的存在。A至F六个区分别为F区(37-47)；A(75-91)；B(163-189)；C(200-210)；D(230-241)；E(247-257)。2P基因聚合酶活性部位B区和C区变异与核苷类似物耐药：由于人类免疫缺陷病毒(HIV)和HBV聚合酶结构的相似性，通过计算机模拟分析将HIV和HBV聚合酶基因分为假想的AE5个活性部位。P基因变异

16、主要见于长期应用拉咪呋定和泛昔洛韦的患者，目前已发现的耐药株中P基因变异是多位点的，但相对集中于P基因酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸(TposineMethionineAsPartieacidAspatieAcid，YMDD)区域，突变为YI(异亮氨酸)DD或YV(缬氨酸)DD。不同的核昔类似物耐药株的变异位点不一致，拉咪呋定耐药株的P基因变异多位于B区和C区，其中以C区YMDD变异最为常见；而泛昔洛韦耐药株的P基因变异多位于B区，两者较少重叠，这对于设计使用不同的核着类似物有重要的指导意义。3乙型肝炎病毒核昔类似物耐药性产生机制：目前体内外实验均证明耐药性的产生与P基因变异有关，但为何P基

17、因变异会导致HBV耐药仍不清楚。大多数核苷类似物要先磷酸化为三磷酸形式，然后才能发挥抗病毒作用，其抑制HBV复制的机理主要是三磷酸化形式的核苷类似物可与正常核苷酸发生竞争性结合至延长中的DNA链，由于其缺乏3，OH，不能形成正常的3，5，磷酸二酯健，导致HBV复制的终止。HBV多聚酶是由P基因编码的，从艾滋病病毒(HumanlmmunodeficiencyVirus，HIV)P蛋白的结构模型研究中发现，P基因特定部位的突变会直接或间接影响多聚酶活性部分，影响酶催化活性部分与模板链的结合，降低复制效率。由于HIV与HBVP蛋白结构的相似性，推测sHBVP基因突变会导致复制过程中核苷类似物掺人新生

18、链功能下降，链终止作用减弱，药效降低，故产生耐药。但其确切机制仍有待阐明。4拉咪呋定抗药性耐药与变异：核苷类似物需服药一年以上，因此HBV对核苷类似物的耐药不可避免。病人一旦有可能发生核苷类似物耐药，合理观察和处理非常重要。虽然，出现YMDD突变后多数病人没有导致临床症状加重，但是，多数病人随着血清YMDD突变株的出现，HBVDNA水平反跳，ALT复升且渐趋向于治疗前的基线值。体外试验几乎所有拉咪呋定耐药林均有YMDD区域的变异，伴或不伴有其他位点的变异。此变异位点在HIV研究中早巳发现与拉咪呋定耐药性有关。在HBV体外实验中也证实P基因变异可导致耐药性的产生Bartholomew等选择其中一

19、位复发患者治疗前血清和复发后血清在体外培养系统中感染肝细胞，用不同剂量的拉咪呋定抑制HBV复制，结果在治疗前血清感染组，003mol1拉咪呋定即可抑制HBVDNA达94，而复发后血清感染组用30gmol1拉眯呋定抑制HBvDNA才80，HBVP基因变异株对拉咪呋定的敏感性只有野株的145。Fischer等通过定点诱突技术构造了鸭肝炎病毒(DuckHepatitisBVirusS，DHBV)YMDD区域第512位氨基酸MV的点突变，突变后的DHBV在40umol1拉咪呋定作用下抑制病毒复制作用才80，而ZmoVl拉咪呋定抑制野株复制达92。发生率亚洲地区对357例拉咪呋定治疗的慢性乙型肝炎中的5

20、8例进行长期治疗随访研究，结果发现YMDD突变率随着疗程的延长而增加，在治疗14年分别为17、40、55和67，发生YMDD突变者ALT和HBVDNA平均水平高于未发生的病例，但低于基线水平。39例出现YMDD的病例33发生HBeAg血清转换和59出现ALT复常。结果说明尽管治疗中发生YMDD突变，长期拉咪呋定治疗仍取得明显的疗效。在广州南方医院接受拉咪呋定治疗的198例慢性乙型肝炎和肝硬化患者，用药时间从9个月36个月不等，对每例病人均定期收集其系列血清标本。发现其中20例出现临床耐药，即HBVDNA水平在治疗过程中升高，从治疗开始到出现耐药的平均时间为13个月(9-31月)，对治疗前后HB

21、VP基因进行测序发现，出现YMDD变异的有19例，其中感染单纯YVDD变异株8例，单纯YIDD变异株6例，5例为HBV野株和YMDD变异株混合感染，对这5例患者进行克隆后测序，发现一种新的突变株G518E和或G520C，目前正在深入研究该毒株的生物学意义。出现耐药突变株后，所有患者均出现HBVDNA定量反跳，14例出现不同程度的ALT升高，病毒反跳后平均2个月出现ALT升高。研究发现治疗前ALT水平、HBV基因型。前CCP变异均与耐药的发生无明显关系。在e抗原阳性患者，出现耐药后ALT水平比治疗前高。一般认为在大多数病人出现YMDD突变后HBVDNA仍持续低水平，继续治疗可维持临床上的完全应答

22、状态。随着疗程的延长，部分病例HBVDNA复升，可伴有肝炎急性发作，有的可发生HBeAg血清转换。按照我国拉咪呋定专家指导小组意见，病人出现耐药，目前无其它更为经济有效的抗病毒方案选择，可在严密观察下继续用药，或加用改用干扰素治疗。如出现ALT增高持续大于正常值10倍以上，或出现明确的胆红素升高，临床症状加重，应继续用拉咪呋定，并加用其它护肝药。特别是对于失代偿肝硬化患者更不应随意停药。目前报告的拉咪呋定治疗中或停药后肝衰竭病例多数与治疗病例选择不妥或随意停药有关。比如新近中国医学论坛报载载ClinlnfectDis上的拉咪呋定YMDD引起突变导致致命性亚大块坏死1例。我们认为有条件的单位开始

23、抗病毒治疗前尽可能进行肝活检，确定肝组织病变程度，以减少抗病毒治疗的盲目性。核苷类似物的上市，为我们提供了新的抗HBV药物选择。然而，我们必须重视这些药物的耐药性，应尽早出台我国的抗病毒药物使用政策，形成全国各级医院参与的耐药监测网络，并选择几所中心城市大医院成立标准化的病毒耐药监测中心，定期通报HBV耐药研究情况。国内外专业人员(含管理人员)应定期开会讨论耐药研究方面的合作。制定严格的抗病毒药物使用制度，必须有合格专科医师的处方，上级医师对处方的审核，才可开始抗HBV治疗。同时应严格掌握卫生部批准的使用适应症。现阶段对肝组织学正常的慢性无症状携带者不宜盲目急于使用核苷类似物进行抗病毒治疗。随

24、着抗HBV核着类似物的临床应用，如何组织和发展核苷类似物HBV耐药性监测计划，并指导各级医院和国家的抗HBV耐药监测的规范和管理，正确认识核苷类似物耐药性，这些问题已成为临床医师关注的焦点，研究HBV耐药性对治疗效果的影响可能有重要的临床价值。到目前为止发现的HBV耐药毒株大多为低复制毒株，YMDD突变后HBVDNA反跳在一些病例可引起肝炎活动加重。YMDD以外其它部位的突变很少，而且这些变异点的意义远未阐明。正如抗生素的应用可以导致细菌耐药性的产生一样，一方面我们应该重视拉咪呋定耐药性的研究，同时不应该由于拉咪呋定耐药性的产生，否定拉咪呋定的疗效。三、乙型肝炎病毒S基因变异1S基因及其编码蛋

25、白的结构与功能：S基因位于核苷酸(nt)第155-833位，编码226个氨基酸残基的外膜主蛋白即HBcAg，后者是引起机体产生保护性免疫的主要成分，它有一个免疫优势表位称为“a”决定簇，在所有亚型中均存在。由被动免疫产生的抗体90是针对“a”决定簇，此种抗体可对所有亚型的HBV感染提供保护性免疫。“a”决定簇位于氨基酸124-147位，是HBV各亚型的共同决定簇，有一定的空间构型。“a”肽段中几个、甚至单个氨基酸的改变，将破坏构型的稳定性，从而改变其抗原性和免疫原性。2S基因变异与免疫接种：国际上普通推广的乙肝免疫接种可在相当大程度上降低HBV感染率，但尽管经过正规的主动及被动免疫仍出现一些个

26、例感染HBV，其原因之一是出现免疫逃避现象。最常见的是G145R变异，这种变异株较原型毒株有生存优势，体外实验证明了G145R突变株的免疫原性及与原型毒株抗HBS的结合力均发生明显变化。此种变异株对动物有传染性和致病性，同时具有免疫原性。对这一变异株的产生机制目前仍不明，有人认为这种变异株是母亲体内的少数毒株经垂直传播给婴儿后，经免疫选择成为婴儿体内优势株；也有人认为母亲体内无这种突变株，是原型毒株在婴儿体内免疫压力下发生变异的结果。随着疫苗的广泛推广，促使HBV发生变异的免疫压力逐渐增大，变异发生机会增加，幸而G145R突变株表达的HBsAg还能为多数常规诊断试剂所检出。3S基因变异与HBI

27、G预防移植后肝脏HBV感染：抗HBs可对易感者提供保护性免疫，国际上普遍用HBIG预防移植后肝脏再感染HBV。但近年来发现不少患者经HBIG治疗后仍然感染HBV，经研究发现与HBVS基因变异有关，包括S基因第20、44、114、130、145、184和188位氨基酸等多处变异。结果还发现，HBIG治疗持续时间的长短与S基因变异发生率之间有一定关系，可见HBIG造成的免疫压力促进了S基因变异的发生。在这种免疫压力消失后，这种变异株会逐渐消失，原型毒株成为优势毒株，因此检测此种状态下发现的变异株，不同时间采样可能获得不同的结果。4S基因变异与HBsAg(一)HBV感染问题：中国是一个HBV高感染地

28、区，人群携带率为8-20，估计有13亿HBsAg携带者。广东地区，对抗HBc阳性的人群进行PCR检测发现3人群属于HBsAg阴性HBV感染者。在武汉地区进行的研究发现3040HBsAg阴性慢性肝炎或隐匿性肝硬化病人血清或肝组中存在HBVDNA。过去的研究发现HBV变异是导致HBsAg阴性HBV感染的原因之一。但没有对这种变异的发生率及其对肝脏病情的影响进行研究。HBsAg()HBV感染是临床及流行病学的一大难题，影响对HBV感染的诊断，导致临床漏检及献血员筛检错误。Lai等检测了1471例HBsAg()献血者，ALT升高者中HBVDNA阳性率达9，ALT正常中HBVDNA阳性率为05，可见HBsAg()HBV感染流行相当严峻。HBsAg()与诊断试剂的敏感性、HBsAg滴度等有关，此外还与HBVS基因变异有关。我们曾发现S基因密码子第122和123位之间“a”决定簇前插入2个氨基酸或S基因密码子第123和124位之间多编码了3个氨基酸，此种变异导致HBsAg抗原性发生改变，常规酶联免疫