低温驯化对苗木生理及核酸转录的影响

1、低温驯化对苗木生理及核酸转录的影响左永忠李俊英陆贵巧宋珍武惠肖 以华北落叶松(Larixprinapia rupprechtii)幼苗为材料，研究低温驯化对苗木生长发育有关的某些生理指标以及核酸转录的影响。试验结果表明，冷驯化可以提高植物的抗寒性。冷驯化后的幼苗受到-20低温胁迫时，细胞质膜K+的渗漏比对照少，光合性能提高，RNA和可溶性蛋白质增加。 关键词：华北落叶松，低温驯化，抗寒性 STUDY ON COLD ACCLIMATION IN LARIXPRINAPIA RUPPRECHTII Zuo YongzhongLi JunyingLu GuiqiaoSang Zhen Wu Hui

2、xiao (Forestry college of hebei Agricultural University, Baoding,071000) The effects of cold acclimation on some physialagical responses and nucleic acid transcribe of Larixprinapia rupprechtii seedling were examined. The experiment results showed that the cold acclimation increased freezing toleran

3、ce of seeding. Under the low temperture at -20 condition the leakage of K+ from plasma membrane was decreased, the photosynthesis functional enhanced, the contents of RNA and Soluble protein were accumulated by cold acctimation in seeding Key Words:Larixprinapia rupprechtii, cold acclimation, freezi

4、ng tolerance 低温影响植物的生长，也引起植物一些生理指标的变化。冷驯化降低了小麦和拟南芥的致死温度，转录的mRNA数量增加，翻译出适应低温的蛋白质抗冻蛋白，而DNA的数量较稳定5，6，7。可见，冷驯化过程中，植物抗寒性增强，遗传物质的转录水平发生了变化。过去研究多见于草本植物，本试验以落叶松为材料，了解低温驯化对苗木生长、某些生理指标及遗传因素转译水平的影响。 1材料与方法 1.1材料 将华北落叶松种子用0.5%的高锰酸钾消毒，45水浸24h，然后在25下用光照发芽器进行催芽。出芽后，播种在经高温灭菌(110)的蛭石内，室内培养，光照1700Lux，温度2021，浇霍格兰营养液。

5、1.2方法 1.2.1低温驯化分3种处理：(1)常温(对照)：幼苗2021培养17d；(2)渐冷处理：幼苗2021培养10d后，降至13培养2d，然后再降至5培养5d；(3)骤冷处理：幼苗2021培养12d，然后5培养5d。 1.2.2膜稳定性的测定 参照王震宇等的方法1，每个处理取20株苗，2次重复。幼苗用重蒸馏水冲洗干净，-20冷冻10min，然后放入盛有20ml重蒸馏水的小烧杯中，叶部置于水中，根茎固定于小烧杯的边沿，振荡2h，再静置2h，然后用火焰光度计测定渗漏液中K+的浓度。 1.2.3光合性能测定 取处理(1)的新鲜幼苗，每组20株，2次重复，在-20分别冷冻0min、5min、1

6、0min、15min。将处理(3)在-20冷冻10min，2次重复，每次20株。各处理用CI301PS光合测定仪测定其净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和细胞间CO2浓度。 1.2.4核酸和水溶性蛋白质的测定 DNA的提取按李友勇等的氯仿异戊醇法2。用紫外分光光度计(上海，751型)测得提取液在紫外光谱A230nm、A260nm、A280nm的吸收值，计算收率。 DNA收率(g)=O.D2600.02L稀释倍数原液体积，其中：L为比色杯厚度；0.02为每毫升溶液中含1gDNA钠盐时的光密度；O.D260为260nm处的光密度读数。 DNA的提取采用改良的李向辉的方法4。先用氯仿异戊醇提取总核酸，再

7、用LiCl沉淀RNA，然后吸取一部分进行消化，用721分光光度计测定磷含量，换算成RNA含量(占核酸含量的9%)。 水溶性蛋白质的测定用波钦诺克法3。提取液用H2SO4H2O2消化，测N含量，换算成蛋白质的含量(16%) 2结果 2.1膜透性 幼苗在-20冷冻10min后，测定渗漏液中K+含量的动态变化，如图1所示。图中曲线表明，处理(2)和(3)中幼苗叶片的K+渗漏速度明显低于处理(1)，即低温处理过的幼苗叶片K+的渗漏速度低于常温处理的，而骤冷处理的又比渐冷处理的要低。说明，经过冷驯化，膜的稳定性提高了，而且突然降温比逐渐降温对提高膜稳定性的作用更大。 图1不同处理冷冻后渗漏液中K+含量

8、Fig1Content of K+ in leakage solution after freezen with various treatment 2.2光合性能 将处理(1)的幼苗分别在-20冷冻0min、5min、10min、15min后，测定其光合速率的变化情况，结果如图2所示。不同的冷冻时间对光合作用影响的程度不同。随着冷冻时间的延长，叶片净光合速率降低。冷冻5min后，净光合速率下降较少，说明叶绿体受伤较轻；10min后，净光合速率明显下降，此时叶绿体已受到较大伤害；而15min后，净光合速率已为负值，说明叶绿体已受到严重破坏1，致使光合速率低于呼吸速率。 将处理(1)和(3)的幼

9、苗在-20冷冻10min后，对其净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和细胞间CO2浓度进行测定，结果如表1。经过冷驯化后的落叶松幼苗，净光合速率明显高于常温处理，是常温处理的23倍，而其蒸腾速率和细胞间CO2浓度较低，气孔导度与常温处理的也有较大差别。 图2不同冷冻时间后净光合速率 Fig2The net photosynthetic rate of seeding for diffrent freezen times 表1冷冻后落叶松幼苗光合性能的变化 处理 净光合速率 CO2M.m-2.s-1 蒸腾速率 H2OmM.m-2.s-1 气孔导度 CO2M.m-2.s-1 细胞间CO2 浓度ppm 重

10、复 0.3 0.8 29.8 306.2 (1) 重复 0.4 0.6 41.5 296.2 重复 1.1 0.5 65.7 239.1 (2) 重复 1.0 0.5 57.2 210.9 2.3核酸和水溶性蛋白质 落叶松幼苗中水溶性蛋白和核酸的含量如图3所示：3种处理的幼苗中，DNA的含量基本不变，RNA和水溶性蛋白的含量依次增高，说明低温驯化增加了植物细胞中RNA和水溶性蛋白的数量。而且，处理(3)的数值高于处理(2)。可见，在相同时间的情况下，突然降温比逐渐降温对提高细胞中RNA和水溶性蛋白含量的作用更大。 图3不同处理的幼苗中水溶性蛋白和核酸的含量 Fig3The content of

11、 solubl protein and nucleic acid of seedling with various treatment 3讨论 落叶松虽是较耐寒树种，但-20低温可对细胞造成冻害，引起细胞内结冰。原生质结冰后，体积膨胀，对细胞膜产生压力，而且冰屑的棱角会刺破细胞膜，使膜结构遭到破坏，K+向外渗漏。冷驯化过程中，细胞中可溶性物质增加，原生质浓度增大，冰点降低，因而细胞的抗寒性提高，遭受同样的冻害，膜受损伤较轻，K+渗漏较少。因此，冷驯化可以提高植物的抗寒性。 DNA是主要的遗传物质，代谢相当稳定，受外界环境条件影响较小，一时的低温变化不能改变DNA的含量。但是，DNA大分子中，数

12、以千万计的基因在植物不同发育时期及不同的外界条件影响下，一部分基因启动，一部分基因关闭。低温驯化过程中，有关抗冻的基因被启动，转录水平提高，mRNA的数量增加，从而翻译合成较多的蛋白质，细胞液浓度增大，抗寒性增加。从图3也可以看出，RNA和水溶性蛋白增长的趋势是相同的。 温度是影响植物光合作用的重要因素。不同植株，在相同条件下，光合作用能力不同。耐寒植株受低温危害后，也能保持相对较好的光合性能。经过冷驯化的苗木，体内抗冻蛋白含量高，受冻害后能较好的保持细胞结构的完整，因而光合速率较高，使细胞间CO2浓度降低。处理(3)较处理(1)的气孔导度大，保证了代谢过程气体交换。冷驯化植株受冻害后，膜完整

13、性好，水分散失少，因而叶面蒸腾速率较对照低。 总之，落叶松幼苗低温驯化后，DNA转录水平提高，RNA和水溶性蛋白质的含量增加，质膜稳定，使植株的抗寒能力增强，保持较好的光合性能。因此，低温驯化是提高苗木抗寒性的一条有效途径。并可通过低温驯化，进一步筛选和克隆林木抗冻蛋白基因。 作者单位：(河北农业大学林学院，保定，071000) 参考文献 1王震宇等.缺硼与低温对黄瓜幼苗一些生理反应的影响，植物生理学报，1998，24(1)：5964 2李友勇等.一种快速提取植物总DNA的良好材料与方法，生物技术，1994，4(6)：4042 3X.H.波钦诺克.植物生物化学分析方法，科学出版社，1981：9193 4李向辉等.植物遗传操作技术. 科学出版社，1988：242247 5Sarach J.Gilmour, Ravindra K.Hajela, and Michael F.Thomashow. Cold acclimaltion in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol, 1988, 87:745-750 6Jean Danyluk and Fathey Sarhan. Differential mRNA transcription during the induction of freezing tolerance in spring and