不同硒源对鸡肝脏硒含量和肝各种酶mRNA水平的影响

1、不同硒源对鸡肝脏硒含量和肝各种酶mRNA水平的影响0 引言硒是人和动物所必需的微量元素，其生物学功能主要通过各种硒酶和或硒蛋白表现出来1。研究证实，微量元素硒作为谷胱苷肽过氧化物酶（GPX）2和脱碘酶（ID）3的组成成分，调节着生命体的大部分抗氧化防御机制4-5 以及甲状腺激素的代谢6。目前，有关微量元素硒对动物生长、繁育、代谢、抗氧化能力和免疫能力等方面的调控，已经从分子水平上对其机理进行了诸多研究。在鼠上做了大量的相关研究7-9，而在猪、牛等家畜方面的相关研究比较少10-11，在禽上有关这方面的研究还未见报道，且这些研究所用的硒源大多是无机硒。而本研究室前人的实验结果表明，有机硒源（富硒益

2、生菌和富硒酵母）能显著提高猪、羊的抗氧化能力并能调控血清的甲状腺激素水平12-13；本人先前在鸡上的相关研究结果也表明，有机硒源能显著提高蛋鸡的抗氧化能力14和调控血清的甲状腺激素水平(待发表)，同时能显著提高蛋鸡肝脏的GPX 酶和ID酶的活力（待发表）。本研究从分子水平上比较两硒源（SP 和SS）对蛋鸡肝脏硒含量、肝GPX-4 酶和ID酶的mRNA 水平的影响，旨在揭示富硒益生菌提高禽类抗氧化能力和调控甲状腺激素水平的相关分子机理，以便为富硒益生菌这一有机硒源在禽类生产上的应用提供可信的理论依据。1 材料与方法1.1 主要仪器及试剂亚硒酸钠（Sodium selenite，SS），硒含量为4

3、5.5%，天津市化学试剂研究所产品；富硒益生菌（Se-enriched probiotics，SP），南京农业大学动物医学院畜禽营养代谢病研究室研制（专利号为ZL 2005 100409902），硒含量为50 mgkg-1，其中有机硒含量在90%以上，含产朊假丝酵母109 CFUg-1、嗜酸乳杆菌1011 CFUg-1；益生菌（Probiotics，P），南京农业大学动物医学院畜禽营养代谢病研究室研制，含产朊假丝酵母109 CFUg-1、嗜酸乳杆菌1011 CFUg-1。TaKaRa TaqTM PCR 试剂盒，购自大连宝生物工程有限公司；Trizol Reagent 试剂盒，购自GIBCO

4、公司；LightCycler SYBR Green 染料、定量PCR 仪及其配套的毛细管，购于瑞士Roche 公司。高氯酸、硝酸、盐酸、铁氰化钾均为优级纯；标准硒(GBW(E)080215)，国家标准物质研究中心产品；所用水均为超纯水(电阻为18Mcm-1)。AF-610A 原子荧光光谱仪,北京瑞利分析仪器公司。1.2 日粮配置及日粮硒含量试验采用玉米豆粕型基础日粮，其营养组成除了硒之外，均按照NRC15关于产蛋母鸡所需营养进行配比。将富硒益生菌（SP）和亚硒酸钠（SS）2 种硒源分别以3 个硒水平0.2，0.5 和1.0 mgkg-1 添加到基础日粮中，配制成6 种试验日粮，基础日粮作空白对

5、照，基础日粮中添加益生菌（Probiotics，P）作为益生菌对照。基础对照组和益生菌对照组日粮硒含量分别为0.150 和0.152 mgkg-1；添加SP 的各试验组日粮硒含量依次为0.351、0.646和1.144 mgkg-1；添加SS 的各试验组日粮硒含量依次为0.347、0.652 和1.157 mgkg-1。1.3 试验动物的分组及样品的采集选用南京地区的健康罗曼蛋鸡800 羽（产蛋率约为85%，58 周龄），随机分成8 组，每组5 个重复，每重复5 个鸡笼，每笼4 羽，分别接受7 种试验日粮和1 种基础日粮的处理。1 组为空白对照组饲以基础蛋鸡日粮；2 组为益生菌对照组，在基础日

6、粮中添加益生菌（益生菌添加量与添加1.0 mgkg-1 的富硒益生菌硒组的益生菌数量一致）；3、4、5 组分别为基础日粮中添加0.2、0.5 和1.0 mgkg-1 硒的富硒益生菌（SP）各组；6、7、8 组分别为基础日粮中添加0.2、0.5 和1.0 mgkg-1 硒的亚硒酸钠（SS）各组；自由采食和饮水，用药和防疫按蛋鸡场常规程序进行；所有组均饲喂基础日粮预试2 周后，开始饲喂相应的试验日粮，试验期为35 d。在试验结束时，每重复随机宰杀2 羽鸡，取肝脏于液氮速冻，而后将样品冻存于-70 冰箱备用。1.4 测定指标及方法1.4.1 日粮、肝脏硒含量的测定参照 PAN16的方法，同时用超纯水

7、和硒标准参照物(GBW08551 猪肝，国家商业局食品检测科学院)做空白对照和标准参照物对照，利用氢化物发生-原子荧光光谱法测定日粮和肝脏中硒含量。1.4.2 鸡肝脏 GPX-4 和IDmRNA 水平的测定采用实时 SYBR 荧光相对定量的PCR 方法17-18，检测鸡肝脏中GPX-4 酶和ID酶的mRNA 基因相对表达量。肝组织总RNA 的提取、目的cDNA 的合成（反转录）和SYBR Green实时荧光定量PCR 条件的优化等参照Shunyi Qin19的方法操作。目的引物序列见表2。用Light Cycler 软件对扩增的PCR 产物进行熔解曲线分析以确保PCR 产物的特异性。GPX-4

8、 基因、ID基因和-actin 基因PCR 产物的熔解温度的峰值分别为86.20.4 C、80.60.4 C 和83.00.5C。以-actin 为内标20，利用Ct 值计算不同处理组中GPX-4 和IDmRNA 的相对量。经过内标基因均一化处理后，目的基因（GPX-4 和ID）的mRNA 相对于参照因子的表达量用下述公式计算21： X=2-Ct，而Ct=Ct（样本）-Ct（参照）=（Ct 目的基因-Ct-actin）样本-（Ct 目的基因-Ct-actin）参照。1.5 统计分析采用 SPSS 13.0 软件进行数据统计分析，数据均以平均值标准误（ SE）表示。One-WayANOVA 用来

9、比较各组间相关指标的差异；the Univariate of GLM 用来检验硒源和水平的主效应以及两者间的交互效应。采用最小显著极差法(LSD)对差异显著的数据进行多重比较；显著性差异以P 0.05 为基准。2 结果2.1 硒源和硒水平对蛋鸡肝脏硒含量的影响硒源和水平均能显著(P 0.01)影响鸡肝脏的硒含量，且硒源和水平对肝脏硒含量的影响存在着显著的交互效应(P 0.05)；而添加益生菌对蛋鸡的肝脏硒含量没有显著影响，见表3。从硒源角度考虑，添加SP的蛋鸡肝脏的硒含量分别较对照组和益生菌组的高15.16%(P0.01) 和16.75%(P 0.01)，添加SS 的蛋鸡肝脏的硒含量分别较对照

10、组和益生菌组的高10.73%(P 0.01)和12.26%(P 0.01)，且添加SP 的蛋鸡肝脏硒含量较添加SS 的蛋鸡高4.00%(P 0.05)。在所有添加水平，无论是添加SP 或是SS 的各组，其蛋鸡肝脏硒含量均显著(P 0.05)或极显著(P 0.01)高于对照组和益生菌组。随着硒添加水平的升高，添加SP 或SS 的蛋鸡肝脏硒含量分别依次较前一水平组的高7.00%(P 0.01)、7.58%(P 0.01)和3.40%(P 0.05)、8.29%(P 0.01)。且在相同的添加水平时，添加SP 的各组蛋鸡肝脏硒含量均高于或显著高于(P 0.05)相应添加水平的SS 组。上述结果表明，

11、添加SP 或SS 源硒可提高蛋鸡肝脏硒含量，且随着硒添加水平的每一次升高，蛋鸡肝脏硒含量均显著增高；添加SP 较SS 能显著提高蛋鸡肝脏硒含量。2.2 硒源和硒水平对蛋鸡肝脏 GPX-4 的mRNA 水平的影响由可见，添加SP 的组蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 水平分别是对照组和益生菌组的1.94 倍（P 0.05)和1.80 倍（P 0.05)，添加SS 的组蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 水平分别是对照组和益生菌组的1.95 倍（P 0.05)和1.81 倍（P 0.05)，而添加SP 的蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 相对水平和添加SS 的几乎相等。除了硒添加水平为0.2 mgk

12、g-1 的组外，与对照组相比，添加SP 的2 个组和添加SS 的2个组蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 水平均显著（P 0.05)或极显著（P 0.01)高于对照组。与益生菌组相比，添加SP 的2 个组蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 水平分别显著（P 0.05)和极显著（P 0.01)高于益生菌组；而添加SS 的组，只有硒的添加水平在1.0 mgkg-1 时，蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 水平才极显著（P 0.05)和1.60倍（P 0.05)和1.74 倍（P 0.05)。上述结果表明，添加SP 或SS 源硒均能提高蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 水平，随着硒添加水平的升高，蛋鸡肝脏

13、GPX-4 酶的mRNA 水平有不同程度的增高。但是，硒源、益生菌对蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 水平均没有影响。2.3 硒源和硒水平对蛋鸡肝脏 ID的mRNA 水平的影响硒源和硒水平对蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 的水平均有极显著的影响(P 0.05)。见表5。从硒源来看，添加SP 或SS 的蛋鸡肝ID酶的mRNA 水平分别是对照组的2.22 倍(P0.01)和1.78 倍(P 0.05)；添加SP 或SS 的蛋鸡肝ID酶的mRNA 水平分别是益生菌组的2.00 倍(P 0.01)和1.60 倍(P 0.05)；添加SP 的蛋鸡肝ID酶的mRNA 水平是添加SS 的1.25 倍(P=0.05

14、)。从硒源和硒的添加水平来看，与对照组相比，添加SP 的各组和添加SS 的各组蛋鸡肝ID酶的mRNA 水平均显著(P 0.05)或极显著 (P 0.05)。与益生菌组相比，添加SP 的各组蛋鸡肝ID酶的mRNA 水平分别是益生菌组的1.35 倍(P=0.05)、1.96 倍(P 0.01)和2.68 倍(P0.01)；而添加SS 的，只有在0.5 mgkg-1 和1.0 mgkg-1 的硒添加水平，蛋鸡肝ID酶的mRNA水平才显著高于益生菌组的，且分别是益生菌组的1.62 倍(P 0.01) 和1.96 倍(P 0.01)。与添加SS 的组相比，除了0.2 mgkg-1 的硒添加水平组外，其余

15、2 个SP 硒的添加水平组的蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 水平分别较相应硒添加水平的SS 组高1.21 倍(P=0.05)和1.36 倍(P0.05)。随着硒添加水平的升高，添加SP 的组和添加SS 的组蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 水平均显著(P 0.05)或极显著(P 0.01)高于前一水平组的。上述结果表明，添加SP 或SS 源硒能提高蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 水平，随着硒添加水平的升高，蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 水平显著增高；且添加SP 较SS 能显著提高蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 水平；益生菌对蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 水平没有影响。3 讨论3.1 硒源和硒水平对蛋鸡肝脏硒含量的影响日粮中适量

16、的硒是动物健康生长发育、维持特定生产性能和发挥生物学功能所必须的。本文研究发现，日粮添加0.2 mgkg-1 或以上水平的SP 或SS 源硒均能显著提高蛋鸡肝脏的硒含量，随着硒添加水平的升高，蛋鸡肝脏硒含量也增高。且添加SP 较添加SS 能显著提高蛋鸡的肝脏硒含量高。这些结果与其他研究人员报道的无机硒（主要SS）或有机硒（主要大麦的硒、富硒酵母硒）对组织硒含量的影响结果相似。Hassan 22 报道，与不添加硒的蛋鸡相比，来源于大麦的硒能显著提高蛋鸡肝脏组织的硒含量；Tarla 等23报道，随着日粮中无机硒含量的增加，肉鸡肝组织的硒浓度也显著增加；Mahan 等24报道，较高水平的硒(0.3

17、mgkg-1)，特别是有机硒源的富硒酵母硒在提高肝、腰肌、胰腺和其他肌肉组织硒含量上要优于SS。Payne RL 25等报道，有机硒的富硒酵母(SY)硒较SS 能显著提高肉鸡肌肉组织的硒含量。3.2 硒源和硒水平对蛋鸡肝脏 GPX-4 的mRNA 水平的影响GPX-4 是含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase ，GPX)的一种，它被称为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（Phosthepholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase，PHGPX，GPX-4），它有广范的底物特异性，这些底物包括过氧化氢以及一系列复杂的脂质过氧

18、化物，如磷脂过氧化氢物和胆固醇过氧化氢物等，因而GPX-4 在保护细胞膜免遭脂质过氧化反应中发挥着重要的作用26-27。目前发现：此酶在啮齿类和哺乳类动物的睾丸组织有较高的表达28，而在其它的组织细胞中表达量较低29。在鸡的大脑和卵巢基质上非线立体型的GPX-4 酶均有高表达，且在卵巢基质的表达量因繁殖状态的不同而大不同30。目前，有关于硒对啮齿类和哺乳类动物GPX-4 酶mRNA 表达水平的影响报道，各家也不一致。有的认为硒水平对GPX-1 酶的mRNA 表达有影响，而对GPX-4 酶的mRNA 没有影响。如Bruzelius K 等11报道硒水平能影响乳腺组织GPX-1、GPX-3 和硒蛋

19、白P 的mRNA的表达，而对GPX-4 和硫氧还蛋白还原酶1 的mRNA 没有影响；Sherri WEISS SACHDEV等31报道，补硒能显著提高大鼠肝脏GPX-1 的mRNA 水平，而对GPX-4 的mRNA 水平影响较小。也有的认为硒水平对GPX-1 酶和GPX-4 酶的mRNA 表达都有影响。如，Xin Gen Lei等32报道，给断奶仔猪饲喂低硒(0.04 mgkg-1 的硒)日粮，其肝脏GPX-1 和GPX-4 的活性和mRNA 表达水平显著低于补硒组的，且在0.2 mgkg-1 的硒添加水平时达到峰值；KylieVenardos 等33报道，补硒(1.0 mgkg-1 的硒)能

20、显著上调大鼠心脏GPX-1 和GPX-4 的mRNA表达。上述报道不一致的原因，可能与种属特异性（猪和鼠）、组织分布特异性（肝脏、乳腺及心肌）、缺硒的程度、补硒的量以及硒的形态等有关。然而，有关于硒对鸡肝脏GPX-4酶表达的影响还未见报道。本实验在鸡的研究上发现，添加一定水平的SP 或是SS 均能显著增加蛋鸡肝脏GPX-4酶的mRNA 表达，这一结果分别与Xin Gen Lei 等32在猪肝脏和Kylie Venardos 等33在大鼠心脏方面的研究结果相似。并且本实验发现，当日粮中添加0.2 mgkg-1 的SP 或SS 源硒时，没有显著提高蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA表达量，而当日粮中

21、添加0.5 mgkg-1 和1.0 mgkg-1的SP 或SS 源硒时，均能显著提高蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 表达量，且随着硒添加水平的升高，蛋鸡肝脏GPX-4 酶的mRNA 表达量也显著增加。而本人在鸡上的相关研究表明：日粮中添加0.2 mgkg-1 的SP 或SS 源硒时，能显著提高肝脏硒含量（见前文），同时也能提高肝脏GPX 酶的活性（待发表），且随着硒添加水平的升高，添加SP 较SS 能显著提高蛋鸡肝脏的硒水平和GPX 酶的活性。而根据资料，肝脏GPX 酶主要指GPX-1 酶，而GPX-4酶含量比较低，且GPX-4 酶主要存在于鸡的卵巢组织和大脑30。所以，本人认为：硒源和硒水

22、平可能主要影响肝GPX-1 酶的高表达需求，特别是在机体较低硒水平时，首先要满足肝脏GPX-1 的表达以便维持机体正常的抗氧化能力，而对GPX-4 酶的表达需求只能是依据肝硒的储存状态而定了，当然这需要进一步的研究来证实。3.3 硒源和硒水平对蛋鸡肝脏 ID的mRNA 水平的影响ID是含硒半胱氨酸的脱碘酶(Iodothyronine Deiodinase ，ID)的一种34，主要存在于动物的肝脏、肾脏和骨骼肌，它可以催化无活性的3,3,5-四碘甲腺原氨酸(T4)脱去其5-碘生成有活性的3,5,3-三碘甲腺原氨酸 (T3)，从而发挥生物学功能35。目前，已经从一些动物(人、鼠、 狗、 鸡) 36

23、-39 得到了ID cDNAs 的克隆，同时也有一些有关硒对ID酶在转录或翻译水平上影响的研究报道，但大多研究的动物是老鼠。Diane De Palo 等40认为，缺硒能使老鼠肾脏ID的mRNA 水平降低40%，而对肝脏ID的mRNA 水平没有影响；Roger A 等9也报道，缺硒没能引起老鼠肝脏ID的mRNA 水平的下降，在哺乳期，硒的水平对肝脏ID的mRNA 水平没有显著的影响；Mitchell JH 等41则报道，缺硒能引起老鼠肝脏ID的活性和mRNA 水平的下降。而高建忠42在断乳仔猪上的相关的研究表明，补充富硒益生菌、富硒酵母和亚硒酸钠均可促进仔猪肝脏ID的mRNA的表达，而硒源之间

24、没有明显的差异。本研究发现，添加SP 或SS 源硒均能显著增加蛋鸡肝ID酶的mRNA 表达，且SP 硒对蛋鸡肝ID酶的mRNA 表达的影响要优于SS 硒。另外，随着硒添加水平的每一次升高，蛋鸡肝ID酶的mRNA 表达均显著升高。这说明，蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 表达主要受日粮硒源和硒水平的影响，且蛋鸡肝脏ID酶的mRNA 表达量与硒的添加水平存在着明显的量-效关系。而本人前面的相关研究发现（待发表），日粮添加SP 时，随着硒添加水平的每一次升高，蛋鸡肝ID酶的活力均显著升高，而当添加SS 硒时，蛋鸡肝ID酶的活力只是在0.5 mgkg-1 的硒添加水平时显著高于0.2 mgkg-1 的硒添加水

25、平时的肝ID酶的活力，而在1.0 mgkg-1 的硒添加水平时却显著地下降，降到几乎与0.2 mgkg-1 的硒添加水平时的肝ID酶的活力相等。这说明，在高水平（1.0 mgkg-1）添加硒时，添加SP 的蛋鸡肝脏ID酶的活力随着mRNA 表达水平的升高而升高，也即蛋鸡肝脏ID酶的活力变化与ID酶的mRNA表达水平的变化具有一致性，而添加SS时，蛋鸡肝脏ID酶的活力并没有随着mRNA表达水平的升高而继续升高，这提示，不同硒源（有机硒和无机硒）在高水平（1.0 mgkg-1）添加硒时，对蛋鸡肝脏ID酶的影响机制是有差异的，当然这其中的机理还需进行深入的研究。因为硒对基因调控的影响是复杂的，这需要

26、考虑到硒在不同组织、不同细胞的吸收、分布及其代谢等情形，同时也要考虑到机体的整体调节性。4 结论硒源可显著影响鸡肝脏硒含量以及ID酶的mRNA 水平；硒的水平对肝组织硒含量、肝GPX-4 酶和ID酶的mRNA 水平均有显著影响；添加SP 较SS 在肝脏的沉积较多；SP上调鸡肝脏ID酶的mRNA 水平的能力较SS 强；益生菌对蛋鸡肝脏硒含量和肝脏GPX-4酶、ID酶的mRNA 水平均没有显著影响。中国医学论文网专业提供医学论文发表服务，并提供大量全科医学论文，如有业务需求请咨询网站客服人员！参考文献 (References)1 Wedekind KJ, Yu S and Combs GF. Th

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