使用离子色谱法直接检测尿素溶液及尿素蛋白缓冲液中的氰酸根

1、使用离子色谱法直接检测尿素溶液及尿素蛋白缓冲液中的氰酸根摘要：本文提供一种使用离子色谱抑制型电导法直接检测尿素溶液及尿素蛋白缓冲液中氰酸根的方法。采用IonPac AS15 分析柱，使用电解淋洗液发生器在线产生高纯氢氧化钾淋洗液。利用高容量和特殊选择性分析柱，可有效兼容高浓度氯离子和磷酸根基体。我们针对方法检测线性、系统噪音、量化限和检出限进行了整体评估，证明该法稳定可靠，抗干扰能力强。 关键词：离子色谱；尿素；氰酸根； 尿素作为一种化工原料被广泛应用于蛋白质提纯，包括商业用途的重组细胞蛋白分离提纯、重组蛋白制造业中蛋白质的变性及溶液化。一些蛋白质在中等浓度（4-6M）的尿素中很容易溶液化和变

2、性，而大多数则在较高浓度（8-10M）下溶液化和变性。尿素在水溶液中降解为氰酸盐和铵盐。在接近中性pH，即典型的生物缓冲pH范围时，氰酸盐转化率最高。 氰酸根可通过与自由氨基、羧基、巯基、咪唑、酚、羟基、磷酸盐基团反应使蛋白质氨基甲酰化。从而改变蛋白质的稳定性、功能、有效性。因此，需要对其含量进行有效控制。尿素溶液通常需要消电离以去除氰酸盐。但尿素缓冲体系中氰酸根含量依旧较高，一些尿素缓冲体系显示氰酸盐浓度高达20mM。为在高离子强度基体中测定氰酸盐，建立一种准确、灵敏的方法十分必要。 离子色谱法（IC）检测氰酸盐效果很好，2004年已有使用了戴安公司的IonPacAS14型阴离子分析柱抑制型

3、电导检测法检测氰酸盐的文章发表。但存在诸如方法灵敏度和基体局限性等问题。本文中，选用氢氧根体系色谱柱进行分离，电解淋洗液发生器产生25 mM KOH作为淋洗液，抑制型电导检测。可以改善灵敏度，减少淋洗液消耗，允许更高的样品吞吐量。实验过程中对氰酸盐的线性范围、方法检出限、精密度、回收率及稳定性进行了测试，取得了满意的结果。 1 实验部分 采用ICS-3000型离子色谱仪（美国Dionex公司）。色谱柱为IonPacAS15，使用RFIC免化学试剂离子色谱系统，在线产生所需浓度淋洗液，抑制型电导检测。 尿素溶液需在-20°C或-40°C下冷冻保存，使用前解冻。或者根据氰酸盐浓

4、度随时间和温度的变化每日配制。 为了优化条件、减少选择色谱柱所需时间。我们使用变色龙虚拟柱模拟分离条件。（由于软件虚拟组分不包括氰酸盐，我们使用在氢氧根体系中具有相似保留行为的亚硝酸盐代替）。模拟在30°C以等度氢氧化物为淋洗液的条件下，氯化物、亚硝酸盐、碳酸盐、磷酸盐的分离情况。结果表明， IonPac AS15阴离子色谱柱使用20 mM KOH，可提供最佳的氯化物/亚硝酸盐及亚硝酸盐/碳酸盐分离度。图1为根据虚拟柱结果选择条件后的实际氰酸根样品分离谱图，与模拟条件相吻合。 2 结果与讨论 该方法适用于检测稀释50倍后的8 M尿素溶液；8 M尿素与1M氯化物；8M尿素与1M氯化物及

5、50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 8.4）体系。氰酸根峰可与氯离子及碳酸根峰很好的分离，并且具有良好的峰型（图2）。可以观察到尿素溶液中一个可接受的基线漂移(<0.15 S)。该漂移在2.4min开始，大约15min结束。在含有摩尔浓度含量水平氯离子的尿素溶液中，氰酸根在较大氯离子峰的背景下淋洗，没有与氯离子完全分离（图 3）。其色谱图与含有氯离子及磷酸根的尿素溶液色谱图相似（图4）。 实验表明，在-40°C的贮存条件下，8M尿素中氰酸根总浓度是稳定的。然而，在4°C的储存条件下，四天后氰酸根浓度增长了10倍以上（从6到75M），在25°C下储存增长的更多（从24到886M）（图5）。在8M尿素与1M氯离子混合液、8M尿素与1M氯离子及50 mM磷酸根缓冲溶液中，氰酸根与在8M尿素溶液中具有相似的稳定性。磷酸盐缓冲溶液不会抑制尿素中氰酸根的聚集。 3结论 尿素分解所产生的氰酸根，对于用于蛋白质纯化的尿素缓冲溶液是一种不必要的污染物。本文使用高容量离子交换色谱柱及抑制型电导检测器，准确测定出了稀释50倍后的8M尿素及含有高浓度氯离子和毫摩尔浓度磷酸根的尿素溶液中低浓度(M)的