DNA和RNA合成修饰酶

1、第二章 DNA和RNA合成修饰酶 一、填空题 1 连接酶(Hgase)是一类用于核酸分子连接形成键的核酸合成酶，有 DNA连接酶和RNA连接酶之分。 2 原核生物主要有两种类型的DNA连接酶：E.Coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。 基因工程中使用的主要是T4 DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的中分离的 一种单链多肽酶，分子量为kDa，由T4噬菌体基因编码。 DNA 连接酶是由大肠杆菌基因编码，也是一条多肽链的单体，分子量为 kDa。这两种DNA连接酶有两个重要的差异：第一是它们在催化反 应中所用的能量来源不同，T4 DNA连接酶用， 而 DNA连接酶 则用作为能源。第二是它们催化平末

2、端连接的能力不同，在正常情况下 只有T4DNA连接酶能够连接平末端，E.Coli DNA连接酶则不能。即使是调整反应 条件，E.coli DNA连接酶催化平末端的连接效率也只有T4 DNA连接酶 的。 3 DNA连接酶的单位通常用Weiss单位表示，一个Weiss单位是： 4 DNA聚合酶I是在1965年从大肠杆菌细胞中分离的，所以又称 为聚合酶。该酶由大肠杆菌基因编码，是一种单链球蛋白， 分子量为109kDa，酶蛋白中含有一个Zn原子。 5 T4 DNA聚合酶与Klenow酶一样，具有53聚合酶和35外切酶两种活性， 但是它的35外切酶的活性比Klenow酶强倍。该酶的35外切活 性既能作用

3、于单链DNA也能作用于双链DNA，不过作用于二链的活性 要强于链。 6 反向转录酶(reversetranscriptase)是由kDa和kDa两个亚单位 组成的二聚体，作用时以RNA为模板合成DNA。 7 从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 ，同时释放出游离的无机磷。催化反应时不需，但 需要引物，单链DNA是最好的引物，单链DNA受体的长度最短需有个、 dNTP。具有3突出末端的双链DNA也是较好的反应底物。二价离子和DNA末端 状态对催化反应影响较大，但是用作为辅助离子，可以催化任何形式 的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸，但突出的3端效率较高。 以Mn2+ Mg

4、2+作为辅助因子，只能在单链DNA或双链DNA的3突出端加尾。 8 S1核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离纯化的一种含的 金属蛋白，分子量为32kDa,是一种耐热的酶(3765)。 9 在S1保护实验中， S1切割的温度有两种：20和45， 这是因为：在20时， 一；在45时，-. 10.技术可以用来鉴定DNA分子中与DNA结合蛋白相互作用 的特定序列。 11真核生物有两种DNA连接酶，连接酶I主要是参与，而连接酶 则是参与。 12T4RNA连接酶是1972年发现的，并于1977年纯化。该酶是由T4噬菌体基因一-编码，作用是不需要模板。它在

5、体内的作用是参与T4噬菌体， 它不参与DNA合成的连接，但在中可能有作用。 13DNA聚合酶I的Klenow大片段是用切割DNA聚合酶I得到的分 子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性： (1)； (2)一的活性。 14反向转录酶除具有以DNA和RNA为模板合成DNA的5-3合成酶的活性外， 还具有4种酶的活性：(1)；(2)； (3)一；(4)。 15RNA连接酶作用时除了需要ATP和Mg2+外，还需要。 16DNA聚合酶I是一种单体酶，分子量为109kDa，它含有金属离子。 17为了防止DNA的自身环化，可用脱去双链 DNA。 18T4单核苷酸激酶进行DNA片段的5端标记时，主要是通过两

6、种反应即 和。 19CIP催化脱磷酸时有两种最适温度，一种是37，适用于端脱磷酸；另 一种是56，适用于端脱磷酸。 20切核酸酶可从双链DNA的5端依次切下5单核苷酸，但对不同末端的底物来 说，作用效率不同，最高，最低。 21EGTA是一离子螯合剂。 22测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有酶的活性，而没 有-酶的活性。 23切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用的 和的作用。 24.欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采 用或-. 25反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的水

7、解掉。 二、判断题 1 T4DNA连接酶和Ecoli连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。 2 T4DNA连接酶和Ecoli连接酶都能催化双链DNA和单链DNA的连接。 3 反转录酶能够以单链RNA或单链DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的 DNA链。以RNA为模板合成的DNA是互补DNA(complementary DNA，cDNA)。 若是以DNA模板合成DNA，dNTP的掺人速度很低(约5个核苷酸秒)，比T7DNA 聚合酶的合成速度差不多低100倍。 4 以RNA为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的cDNA，双链DNA是由自身 引物引导合成。但这种自身引物引导的合成效率远低于外

8、加寡核苷酸引物引导 的合成。 5 Bal31核酸酶(Bal31nuclease)是Ca2+依赖性的，在反应混合物中加入EDTA便可抑 制它的活性。 6 切核酸酶不能在双链DNA的gap和nick处切割DNA。 7 当一个DNA结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯 键免遭切割，其结果，电泳胶上就有明显可见的空缺带(与对照相比)，这就是DNA 足迹法。 8 T4DNA连接酶和Ecoli连接酶作用时都需要ATP和NAD+作为辅助因子。 9 多核苷酸激酶之所以能够用于DNA片段的标记，是因为它能够将单个的32p标记的 单核苷酸加到每一DNA链的5，端。 10在反转录过程中，使用

9、AMV比使用M-MLV可得到较多的产物。 11真核生物可能有两种DNA连接酶，连接酶I和连接酶都能在DNA合成和连接中 起作用。 12DNA聚合酶I有三种酶活性，其中3，-*5，外切核酸酶的活性在较多的dNTP存在 下，常被5，-*3，合成酶的活性所掩盖。 13用同一种酶切割载体和外源DNA得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用CIP 将它们脱磷酸。 14切核酸酶的作用产物可以作为末端转移酶的作用底物。 15用外切酶作系列缺失突变时，可以从突出的3端开始。 16 nick和gap的含义是不同的，前者指DNA的单链中有较小的缺失，后者仅是断开 了一个磷酸二酯键。三、选择题(单选或多选) 1 T

10、4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的Ecoli中分离的，这种连接酶( ) (a)催化连接反应时既能以ATP又能以NAD作为能量来源 (b)既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 (c)是一种单肽酶，分子量为74kDa (d)既能催化单链DNA连接又能催化双链DNA连接2 DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( ) (a)将双链DNA分子中的5磷酸基团同3-OH末端重新形成磷酸二酯键 (b)作用时不消耗能量 (c)需要Mn2+等二价辅助离子 (d)也可以连接RNA分子3 在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( ) (a)T4DNA聚合酶 (b)Klenow

11、酶 (c)大肠杆菌DNA聚合酶I (d)T7DNA聚合酶 4 末端转移酶是合成酶类，( ) (a)作用时不需要模板 (b)在Co2+的存在下，可以在突出的3末端延长DNA链 (c)在C02+的存在下，可以在隐蔽的3末端延长DNA链 (d)上述说法有两种是正确的 5 在以下关于噬菌体SP6RNA聚合酶特性的描述中，( )是不正确的。 (a)能够特异性识别SP6启动子 (b)可能在DNA模板的切口(nick)处停止 (c)具有抗酸酶活性 (d)用于体外标记RNA探针。 6 在基因工程中，可用碱性磷酸酶( ) (a)防止DNA的自身环化 (b)同多核苷酸激酶一起进行DNA的5末端标记 (c)制备突出

12、的3末端 (d)上述说法都正确 7 从Ecoli中分离的连接酶： ( ) (a)需要ATP作辅助因子 (b)需要NAD作辅助因子 (c)可以进行平末端和黏性末端连接 (d)作用时不需要模板 8 下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性 (a)核酸外切酶 (b)外切酶 (c)单核苷酸激酶 (d)碱性磷酸酶 9 下列哪一种酶作用时需要引物? ( ) (a)限制酶 (b)末端转移酶 (c)反转录酶 (d)DNA连接酶 10EDTA是一种螯合剂，可以抑制大多数酶的活性，但在下列酶中，( )不受它的 影响 (a)外切酶 (b)EcoRI (c)Bal31核酸酶 (d)Pstl 11S1核酸酶的功能是( )

13、 (a)切割双链的DNA (b)切割单链的RNA (c)切割发夹环 (d)以上有两项是正确的 12Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了( )的活性。 (a)53合成酶 (b)35外切酶 (c)53外切酶 (d)转移酶 13用Bal31核酸酶作系列缺失突变时，( ) (a)缺失从一端开始 (b)需要Mg2+作辅助因子 (c)需要Ca2+作辅助因子 (d)以上有两项是正确的 14在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( ) (a)限制性内切核酸酶切除 (b)用3外切核酸酶切除 (c)用S1核酸酶切除 (d)用5外切核酸酶切除 15切核酸酶：( ) (a)作用时不需要模板 (b)可以从3末端降

14、解DNA (c)可以从nick部位降解DNA (d)可以从gap部位降解DNA 16 T4RNA连接酶： ( ) (a)作用时不需要模板 (b)作用时需要模板 (c)是1972年发现的 (d)是1967年发现的 17下列DNA不是ll、切核酸酶作用底物的是( ) (a)具有3突出端的双链DNA (b)具有5突出端的双链DNA (c)切口DNA (d)平末端DNA 18可以在切口部位起作用的酶是( ) (a) S1核酸酶 (b)外切酶 (c) 切核酸酶 (d)Bal31核酸酶 四、简答题 1 按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶。 2 为什么反转录酶在聚合反应中会出

15、错? 3 什么是测序酶(sequenaseTM)? 4 什么是S1核酸酶作图(S1nucleasemapping)? 5 基因工程中，为什么不喜欢用BAP来脱去DNA的5端的磷酸基团? 6 RNaseA和RNaseH在催化活性和应用上有何不同? 7 切口移位(nicktranslation)标记DNA前，用DNaseI处理DNA时，应注意什么? 8 核酸酶与外切核酸酶用于系列缺失突变有什么不同? 五、问答题 1 1967年，有5个实验室几乎同时独立发现了DNA连接酶，每个实验室的实验有什 么特点? 2 简述DNA和RNA连接酶的催化反应机制。 3 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些? 4 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用? 5 如何利用T4DNA聚合酶制备3隐含末端或双链子末端? 6 如何利用T4DNA聚合酶进行双链DNA的3末端标记? 7 如何利用T4DNA聚合酶制备平末端? 8 反转录酶有两种类型，一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV，avian myeloblastosis virus)，另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M-MLV,Moloney munne leukemia virus)，它们之间有什么不同? 9 与EColi RNA聚合酶相比，细菌噬菌体的SP6 RNA聚