层层自组装法制备碳纳米管_酶多层膜电极及其检测酚类物质

1、2009年第67卷第24期, 28572861 化 学 学 报 ACTA CHIMICA SINICA Vol. 67, 2009 No. 24, 28572861* E-mail: yangsmReceived March 29, 2009; revised July 23, 2009; accepted August 28, 2009. 江西省教育厅科技计划(No. GJJ08247)和江西省科技厅支撑计划(No. 赣财教(2007)173号)资助项目.2858化 学 学 报 Vol. 67, 2009反应效应, 能提高酶电极的灵敏度; CNT的良好生物相容性, 有利于保持固定化的酶活性9

2、11 . 然而构筑CNT酶修饰电极的最大难点是CNT在溶剂中的分散, 有机溶剂、CNT的化学修饰、聚合物分散剂或表面活性剂被用来分散CNT制备CNT修饰电极. 有机溶剂的使用会使酶生物活性物质失活, 化学修饰CNT会导致CNT的结构受到破坏而影响其独特性质, 而表面活性剂如SDS能在CNT表面或界面进行规则排列, 形成分子定向排列的层状或特定形状, 从而使CNT能在保持结构完好的同时, 良好地分散于胶束中, 并长时间保持稳定如Yan等1412,13将5 mg的混酸处理过的多壁碳纳米管分散在含1.0%十二烷基磺酸钠的水溶液中, 然后将分散液用高能超声波分散, 直至得到黑色的悬浮液, 多壁碳纳米管

3、浓度为1.0 mg/mL.1.4 (CNT/HRP)n多层膜的制备将石英片在Piranha(浓H2SO430%H2O231)溶液中浸泡15 min, 用去离子水洗净, 先依次在PDDA (1 mg/mL, pH 6.5)、PSS (1 mg/mL, pH 6.5)和PDDA (1 mg/mL, pH 6.5)中浸泡20 min得到前体膜PDDA/PSS/ PDDA, 再分别在带负电的CNT (1.0 mg/mL悬浮液)与带正电的HRP (1 mg/mL, pH 6.5)溶液中组装30 min, 然后重复在CNT与HRP中组装. 石英片上制备的(CNT/ HRP)n多层膜用于紫外-可见光谱表征.

4、PET的预处理及阴离子化参照文献15, 阴离子化的PET按照在石英片上组装的方法制备(CNT/HRP)n多层膜. PET上制备的(CNT/HRP)n多层膜用于SEM表征. 1.5 Au/MPS/PDDA/PSS/PDDA/(CNT/HRP)n电极的制备金电极先用平均粒径为0.05 µm的氧化铝砂浆打磨, 然后清洗, 再在Piranha溶液中浸泡5 min, 取出洗涤, 再在0.1 mol/L H2SO4中进行循环伏安扫描, 扫描范围是1.40.2 V, 直至得到稳定的可重复的循环伏安曲线, 得到的金电极直接用于组装.将预处理的金电极在0.02 mol/L的MPS中浸泡12 h, 然后

5、按照在石英片上组装的方法制备(CNT/HRP)n多层膜电极.1.6 电化学测定将制成的(CNT/HRP)n电极置于含有40 µmol/L H2O2, pH6.5的PBS缓冲溶液中, 使用三电极装置, 工作电极上施加0.05 V (vs. Ag/AgCl电极)的阴极电位, 记录电流-时间曲线, 当背景电流达到稳态后, 用微量进样器注入酚类物质样品, 记录电流响应.用SDS分散的CNT和葡萄糖氧化酶通过层层自组装方法制备性能良好的葡萄糖生物传感器.辣根过氧化物酶是被广泛研究的一种过氧化物酶, 但目前, 用SDS分散的CNT和HRP层层自组装方法构筑HRP多层膜电极的研究还未见报道. 本文

6、用表面活性剂十二烷基磺酸钠分散碳纳米管, 通过静电层层自组装CNT和HRP构筑CNT/HRP多层膜电极, 并用于分析检测酚类物质研究. 用紫外-可见光谱和SEM表征了CNT/HRP的层层自组装过程, 探讨了CNT/HRP组装层数对多层膜电极的电化学响应的影响, 并研究了该多层膜酶电极对邻苯二酚、对苯二酚和苯酚的分析性能.1 实验1.1 试剂邻苯二酚(国药集团化学试剂有限公司); 苯酚(天津市福晨化学试剂厂); 对苯二酚(国药集团化学试剂有限公司); 多壁碳纳米管(纯度90%, 直径1030 nm, 来自Sun Nanotech Co Ltd); 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)(杭州大自然磁带厂

7、); 辣根过氧化酶(250 U/mg, 等电点7.2)、3-巯基-1-丙基磺酸钠(MPS)、聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)均购自Sigma Aldrich. 1.2 实验仪器电化学工作站CHI660C(上海辰华仪器公司); 紫外光谱仪(PerkinElmer Lamdba 35); VEGATESCAN扫描电镜; 超声波清洗器(福州华志科学仪器有限公司); SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司); Gsp-805型圆盘搅拌器(江苏电分析仪器厂电子设备分厂); 三电极体系(铂电极对电极, Ag/AgCl参比电极, 2 mm直径金盘电极为工作电极)

8、. 1.3 CNT分散液的制备称取100 mg CNT, 加入40 mL混酸V(H2SO4)V(HNO3)31, 超声6 h, 抽滤, 用去离子水洗涤至2 结果与讨论2.1 (CNT/HRP)n多层膜的表征我们用紫外-可见光谱对碳纳米管和酶HRP的层层自组装过程进行了监测. 如图1所示, 吸光度随膜层的增加而越来越大, 并发现碳纳米管在波长为265 nm处的吸收出现最大值16,17. CNT/HRP膜的吸光度对层数进行线性拟合(图1插图), 线性相关系数为0.999. 紫外-可见光谱表明SDS分散的CNT与HRP可均匀有效的组装构筑CNT/HRP多层酶膜.pH为中性, 烘干, 研磨至粉末.No

9、. 24杨绍明等：层层自组装法制备碳纳米管/酶多层膜电极及其检测酚类物质2859HRP首先与H2O2反应生成化合物I, 化合物I代表被氧化的HRP(氧化态为5), 它是由一个铁氧体(Fe4O)和卟啉阳离子自由基组成; 化合物I与酚类化合物反应, 得到一个电子后被还原为化合物II, 化合物II再与酚类化合物反应被还原成HRP (Fe3), 酚类化合物则被氧化成酚氧自由基或醌; 被HRP氧化生成的酚氧自由基或醌具有电化学活性, 在电极表面得到电子还原.以邻苯二酚为例, 研究(CNT/HRP)4电极对酚的催化作用, 如图3所示. 没有过氧化氢时, 可以观察到邻图1 CNT/HRP多层膜的紫外-可见光

10、谱图, 扫描波段为2001100 nmFigure 1 UV-Vis spectroscopy of CNT/HRP multilayer, scan wavelength range with 2001100 nm苯二酚的氧化还原峰, 加入过氧化氢后出现了典型的催化还原峰, 即循环伏安图中阴极电流的增加和阳极电流的减少. 如图3可见, 邻苯二酚在0.05 V左右还原, 因此, 为了提高检测酚类物质的灵敏度及减少干扰, 后续电流-时间曲线实验中的电位选择0.05 V.碳纳米管和酶HRP的层层自组装过程也用SEM进行了监测, 如图2所示. 组装两层(CNT/HRP)n时, CNT基本是单根分散在

11、基底上, 没有聚集(图2a); 组装层数增加到五层时, 观察到CNT覆盖度显著提高(图2b). 上述结果表明通过层层自组装方法可将CNT均匀地构筑在PET表面.图3 CNT/HRP电极的循环伏安图Figure 3 Cyclic voltammograms of CNT/HRP electrode1×104 mol/L catechol (a), a1×103 mol/L H2O2 (b)2.3 碳纳米管对电极响应影响为了验证CNT的引入对HRP电极的灵敏度的提高, 我们制备了Au/MPS/PDDA/PSS/PDDA/(CNT/ HRP)4电极与不组装碳纳米管的Au/MPS/

12、PDDA/PSS/ PDDA/(PSS/HRP)4电极, 两个电极对邻苯二酚的电流-时间曲线如图4所示. 由图4可以看出, CNT/HRP电极对邻苯二酚的电流响应比不组装CNT的PSS/HRP电极有着显著的提高, 灵敏度提高约5倍, 这是由于碳纳米管良好的电学性质和高比表面积提高了检测的灵敏度.图2 组装不同层数CNT/HRP的SEM图Figure 2 SEM images of various CNT/HRP layers(CNT/HRP)2 (a), (CNT/HRP)5 (b)2.4 CNT/HRP层数对邻苯二酚响应电流的影响利用层层自组装法得到不同层数的CNT/HRP生物传感器在含有4

13、0 µmol/L H2O2 pH6.5的PBS缓冲溶液中, 连续加入1.37×105 mol/L邻苯二酚得到不同CNT/HRP层数的电极对邻苯二酚的电流响应图(如图5).由图5可以看出: 随着组装层数的增加, 负载的酶量增加, 邻苯二酚响应电流也随之增加. 图1中紫外-可2.2 酚在(CNT/HRP)n多层膜电极上的循环伏安行为HRP在过氧化氢和酚类物质存在时发生的催化氧化还原反应为双底物反应18. 在HRP修饰电极表面,2860化 学 学 报 Vol. 67, 2009图4 CNT/HRP电极和PSS/HRP电极对pH6.5的PBS缓冲溶液中连续加入1.37×1

14、05 mol/L邻苯二酚的电流响应, 电位: 0.05 V, H2O2: 40 µmol/LFigure 4 Current response of CNT/HRP and PSS/HRP elec-trode on successive addition of 1.37×105 mol/L catechol in presence of 40 µmol/L H2O2 in pH 6.5 PBS. Applied potential: 0.05 V苯二酚响应的电流时间曲线图6a为完整的电流-时间曲线图(0880 s), 图6b为低浓度区电流-时间曲线图(0250

15、s), 图中标注加入邻苯二酚的浓度. 电位: 0.05 V, H2O2: 40 µmol/L图6 (CNT/HRP)4传感器在pH6.5的PBS缓冲溶液中对邻Figure 6 The I-t curve of (CNT/HRP)4 electrode on successive addition of catechol in presence of 40 µmol/L H2O2 in pH 6.5 PBSApplied potential: 0.05 V. (a) the total I-t curve (0880 s), (b) the I-t curve of low

16、concentration zone (0880 s), the concentration of added catechol labeled in figure层薄, 该传感器的响应时间迅速, 达95%响应电流的时间约3 s.(CNT/HRP)4电极对对苯二酚, 苯酚也有很好的响应: 随着对苯二酚和苯酚浓度的增加, 响应电流也相应图5 不同层数的CNT/HRP电极对pH6.5的PBS缓冲溶液中连续加入1.37×105 mol/L邻苯二酚的电流响应, 电位: 0.05 V, H2O2: 40 µmol/LFigure 5 Current response of diffe

17、rent layer of CNT/HRPmodified electrode on successive addition of 1.37×105 mol/L catechol in presence of 40 µmol/L H2O2 in pH 6.5 PBS. Applied potential: 0.05 V增加. 对苯二酚的线性方程: I (A)9.81×10107.00×104c (molL1) (R0.995, n13), 线性范围为0.0550×1042.42×104 mol/L, 检测限为1.45×106

18、 mol/L. 苯酚的线性方程: I (A)7.68×1093.57× 104c (mol/L) (R0.995, n17), 线性范围为0.246× 1045.90×104 mol/L, 检测限为2.10×105 mol/L.该(CNT/HRP)4传感器在4 下的冰箱中放置3个星期, 在放置期间每隔3 d测试一次, 3周后该电极保持约62%的活性. 该(CNT/HRP)4传感器连续9次测定6.0 µmol/L的邻苯二酚的相对标准偏差小于4.0%. 2.6 干扰实验和回收率测定(CNT/HRP)4电极在40 µmol/L H

19、2O2 pH6.5的PBS缓冲溶液中, 在测定6.0 µmol/L的邻苯二酚的过程中, 加入2.5倍邻苯二酚浓度的L-半胱氨酸和7倍邻苯二酚浓度的酪氨酸和3倍邻苯二酚浓度的甘氨酸, 均对酚类检测没有干扰影响.为了研究该电极测定酚类物质的实用性, 取南昌孔目湖水样为基体, 用标准加入法测定, 孔目湖水样中酚类物质的浓度低于电极的检测限. 分别加入4, 8和12 µmol/L邻苯二酚标样, 得到满意的回收率, 回收率分别为102.6%, 99.3%和95.6%.见光谱显示碳纳米管的吸收随着组装层数线性地增加, 也证明组装层数的增加, 电极表面酶含量增加, 因此电流响应随之增加.

20、 2.5 酚类物质的测定层层自组装得到的(CNT/HRP)4电极在含有40 µmol/L H2O2 pH6.5的PBS缓冲溶液中依次加入一定浓度的邻苯二酚, 得出电流-时间曲线如图6所示. 该电极对邻苯二酚的校准曲线为I (A)1.44×1080.00248c (mol/L) (R0.997, n22); 该电极具有宽的线性范围, 为1.37×107到9.60×105 mol/L, 灵敏度为0.00248 ALmol1, 该灵敏度比文献报道的碳纳米管修饰HRP电极的高6,19. 根据空白的标准偏差计算该传感器的检测限为1.10×107mol/L

21、. 由于多层膜电极的膜No. 24杨绍明等：层层自组装法制备碳纳米管/酶多层膜电极及其检测酚类物质28613 结论本文采用静电逐层自组装技术将SDS分散的CNT和HRP构筑了CNT/HRP多层膜酶电极, CNT/HRP层层自组装过程用紫外-可见光谱和SEM进行了表征, 结果表明SDS分散的CNT与HRP可均匀有效的组装构筑CNT/HRP多层酶膜. 由于碳纳米管具有良好的电学性质和高比表面积的特性, CNT引入到HRP电极中显著地提高了HRP电极的灵敏度. 本文探讨了CNT/HRP组装层数对电极的电化学响应的影响: 组装层数增加, 电化学响应增大; 并研究了(CNT/HRP)4电极对邻苯二酚、对

22、苯二酚和苯酚的电化学性能: 邻苯二酚的线性范围为1.37×1079.60×105 mol/L, 灵敏度为0.00248 ALmol1; 对苯二酚的线性范围为0.0550×1042.42×104 mol/L, 灵敏度为7.00×104 ALmol1; 苯酚的线性范围为0.246×105.90×10为3.57×104 ALmol1.44678 9 10 11 12 13 14 15molL, 灵敏度1References1 Basova, E. M.; Ivanov, V. M.; Novikova, K. V. J.

23、 Anal.Chem. 2002, 57, 434.2 Moskovkin, A. S. J. Anal. Chem. 2002, 57, 507.3 Rueda, M. E.; Sarabla, L. A.; Herrero, A.; Ortiz, M. C. Anal.Chim. Acta 2001, 446, 269.4 Kuban, P.; Flowers, H. Anal. Chim. Acta 2001, 437, 115. 5 Ruzgas, T.; Csöregi, E.; Emnéus, J.; Gorton, L.;16 17 18 19Marko-Va

24、rga, G. Anal. Chim. Acta 1996, 330, 123.Korkut, S.; Keskinler, B.; Erhan, E. Talanta 2008, 76, 1147. Cai, C.; Chen, J. Acta Chim. Sinica 2004, 62, 335 (in Chinese).(蔡称心, 陈静, 化学学报, 2004, 62, 335.) Iijima, S. Nature 1991, 354, 56.Balasubramanian, K.; Burghard, M. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 385, 452.Rivas, G. A.; Rubianes, M. D.; Rodriguez, M. C. Talanta 2007, 74, 291.Chen, D.; Wang, G.; Li, J. J. Phys. Chem. C 2007, 111, 235