跨膜型与分泌型TNF-α细胞毒效应的比较

1、跨膜型与分泌型TNF-细胞毒效应的比较【摘要】目的TNF存在两种形式，目前研究集中于分泌型TNF(s-TNF)，对跨膜型TNF(TM-TNF)的研究很少，但仅有的资料表明，TM-TNF较s-TNF有更广的杀瘤谱，故本实验拟初步探讨两型TNF杀瘤效应的差异。方法应用生物活性测定法检测两型TNF的胞毒作用，RT-PCR检测靶细胞TNFR mRNA表达水平，DNA梯带、TUNEL和Sub-G1峰检测细胞凋亡，所得结果全部采用t检验。结果TM-TNF不仅能杀伤s-TNF敏感细胞株，而且能有效杀伤s-TNF耐受细胞(HL-60，K562，HepG2,Raji)(P0.01)，s-TNF以诱导坏死为主(P

2、0.01)。结论两型TNF的胞毒作用存在显著性差异，由于TM-TNF在局部发挥作用且以诱导凋亡为主，杀瘤谱较s-TNF更广，故在肿瘤治疗中可能优于s-TNF。【主题词】肿瘤坏死因子-细胞毒性，免疫细胞凋亡 Comparison of the cytocidal effect induced by transmembrane and secreted TNF-alpha Shi Wenfang,Li Zhuoya,Gong Feili,et al.Department of Immunology,Tongji Medical University,Wuhan 430030【Abstract】Ob

3、jectiveThere are two forms of TNF-alpha,mainly secreted TNF-(s-TNF) and transmembrane TNF-alpha(TM-TNF).It has been shown that TM-TNF has a broader cytotoxic spectrum than s-TNF.So this study is decided to find the mechanism responsible for this difference. MethodsThe cytotoxic effect of these two f

4、orms of TNF-alphas were compared by bioassay. The expression of TNFR mRNA is detected by RT-PCR.Differentiation of cell death modes is by DNA ladder,TUNEL and FACS. ResultsThe s-TNF-alpha has been shown to kill only two of the cell lines while TM-TNF-alpha has been found to efficiently exert its cyt

5、otoxic activity on all of the tested cell lines.3 of 6 cell lines expressed TNFRmRNA alone(L929,MCF-7 and HepG2)，2 of 6 cell lines expressed both of TNFR/(HL-60 and K562),the remaining one expressed TNFR alone (Raji).s-TNF-sensitive cell lines expressed TNFR,while TM-TNF can kill target cell lines d

6、isregarding which type of surface TNFR was expressed.It was revealed that TNF- could induce both apoptic and necrotic forms of cell death.TM-TNF- did result in mainly apoptosis,but sTNF- mostly necrosis. ConclusionThere are differnces between these the cytotoxic effects induced by the two forms of T

7、NF-alpha.Since TM-TNF has a broader cytocidal spectrum, induced apoptosis chiefly and shown effect locally,it may be used better and broaderly than s-TNF in the field of tumor therapy.【Subject words】Tumor necrosis factor-CytotoxicityApoptosisTumor necrosis factor-(TNF-)是重要的免疫调节因子，具有杀伤和抑制肿瘤的作用。1988年K

8、riegler等人1发现除分泌型TNF-(secretory TNF-, sTNF-)以外，还存在跨膜型TNF-(transmembrane TNF-,TM-TNF-)。近年的研究资料表明两型TNF-的生物学活性及作用方式不尽一致，如TM-TNF-是通过细胞与细胞间接触，在局部发挥作用，而sTNF- 则可进入血循环作用于远距离组织器官。令人感兴趣的是，TM-TNF-比sTNF-杀瘤谱更广，它可有效杀伤对sTNF-耐受的肿瘤细胞2。但是对于两型TNF-生物学效应及其机制的差异知之甚少。本研究旨在进一步比较与研究两型TNF-胞毒效应的差异、诱导死亡方式及探讨可能引起差异的机制。材料与方法：细胞脂多

9、糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coli 0127:B8,Difco,美国)；放线菌素D(Sigma)；抗TNF-单克隆抗体(邦定公司)；碘化丙啶(PI)。2.细胞培养：用以下细胞系作为靶细胞：HepG2(人肝母细胞瘤)、MCF-7(人乳腺癌)、HL-60(人急性前髓细胞性白血病)、K562(红白血病)、Raji(B淋巴细胞性白血病)、L929(鼠成纤维母细胞)。全部细胞均用含10% FCS的RPMI 1640完全培养基培养。3.TNF-的诱生及两型TNF-的获得：取健康成人静脉血，用常规方法分离单核细胞。105个单核细胞用LPS(100ng/ml)刺激培养16小时，取上

10、清用于检测sTNF；而细胞则用1%多聚甲醛室温下固定15分钟，用PBS洗三次细胞后，继续在完全培养液中培养12小时，以去除固定细胞残留的sTNF-，从而获得TM-TNF-。为了排除结合在单核细胞膜TNFR上的sTNF-的影响，故将细胞在固定后同0.3mol/L甘氨酸，0.15mol/L NaCl(pH3.0)室温下作用20分钟，用PBS洗二次后，备用。4.TNF-生物活性检测：将104靶细胞加入96孔培养板，再加入稀释培养上清，以检测sTNF-；测定TM-TNF-则按效靶比例101向固定效应细胞加入靶细胞，总反应体积为100l/孔，37培养48小时后，每孔加入25l的0.5% MTT，继续培养

11、4小时，弃上清，向孔内加入100l裂解液(50%二甲基甲酰胺，20% SDS)，37摇荡16小时后，在波长570nm下测吸光度(A)值。按以下公式计算TNF-的胞毒效应(即细胞死亡百分率)：用抗TNF-的单克隆抗体可完全拮抗两型TNF-的胞毒效应，从而证实TNF-生物活性检测的特异性。5.RT-PCR：用一步法提取细胞总RNA3。取总RNA 2g,65变性15分钟，加入5逆转录缓冲液4l,0.1mol/L DTT 2l,1.25mmol/L dNTP 8l,Oligo dT 1l,MLV逆转录酶20U，终体积20l,25 10分钟，4260分钟，合成cDNA第一条链；再以此为模板，在同一管内加

12、入TNFR和型两对引物终浓度均为25pmol,10PCR缓冲液10l,Taq酶0.5U,终体积100l,95 1分钟，55 1分钟，753分钟，以不同循环数进行扩增，将其产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳观察。6.DNA梯带：TNF-与靶细胞作用后，收集细胞，离心(3000r/min,10分钟)，用生理盐水洗两次，按常规方法提取DNA，并进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，每个泳道加样5g的DNA。凋亡阳性对照用10-6mol/L地塞米松刺激细胞12小时后分离DNA。7.细胞凋亡原位检测：用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)，该试剂盒购自Boehringer Mannheim

13、GmbH公司，德国，按试剂盒说明书操作。4：收集TNF处理的细胞104，用PBS洗二次后，将细胞悬浮于200l的PBS中，并快速加入到70%的冷乙醇中固定，边加边振荡，置4固定过夜。再用PBS洗细胞二次，经RNA酶在37水浴中消化1小时后，置冰上，加0.5ml的PI染液(100g/ml PI,0.1%柠檬酸钠，0.1% Triton X-100)置4染色半小时以上，用FACSort分析5000个细胞中亚二倍体细胞DNA含量。9.统计学分析：实验结果用均值标准差表示，组间差异显著性用t检验分析。结果：分别用sTNF-及TM-TNF-作用于6种不同类型的细胞系，结果如1、2。 sTNF-仅能有效杀

14、伤L929及MCF-7两株细胞系(P0.001)，而其它4株细胞系则对之不敏感；TM-TNF-可有效杀伤实验所用的全部靶细胞系(P0.001),而且对L929及MCF-7的胞毒效应与sTNF-相近；未用酸处理的效应细胞组对部分靶细胞系(MCF-7、HL-60、Raji及L929)的杀伤效应较酸处理组更明显(P0.05)。1分泌型TNF的胞毒效应Fig1. Cytotoxicity of sTNF in the culture supernatant from the monocytes stimulated by LPS Control:Supernatant from the residen

15、t monocytesTNF:Supernatant from LPS stim ulated monocytes2跨膜型TNF的胞毒效应Fig2.Cytotoxicity of TM-TNF on the paraform aldehyde fixed monocytes Control:Fixed monocytes without LPS treatment Mixed TNF:Fixed LPS-stimulated monocytes without acid treatment TM-TNF:Fixed LPS-activated monocytes with acid treat

16、ment2.两型TNF-细胞毒效应与受体关系的比较：RT-PCR分析以上6株细胞系TNFR的表达，结果见3。经扩增27个循环后，可见K562与HL-60的主带是型TNFR，但也可见较弱的型TNFR带；Raji仅见型TNFR带；L929、MCF-7和HepG2则仅见明显的型TNFR带，当将PCR循环次数增加到32圈时，MCF-7和HepG2可见微弱的型TNFR带(结果未显示)。结合1、2分析两型TNF-胞毒效应与TNFR的关系，可见TM-TNF-可有效杀伤表达任何类型TNFR的靶细胞，而sTNF-对仅表达或主要表达TNFR的细胞系Raji、K562和HL-60均无作用，其敏感细胞系则限制在主要表

17、达TNFR 的细胞系中(L929、MCF-7)。尽管如此，主要表达TNF的HepG2对sTNF也呈抗性。3RT-PCR分析不同细胞系TNFR的表达Fig3. The analysis of two distinct types of TNFR expression by various cell lines with RT-PCR1:K562,2:Raji,3:HL-60,4:L929,5:MCF-7,6:HepG23.两型TNF-细胞毒效应时诱导细胞死亡方式的比较：TNF-发挥胞毒效应,既可引起细胞坏死，也可引起细胞凋亡。DNA梯带结果证实(4a)TM-TNF-作用靶细胞的DNA与地塞米松阳

18、性对照组一样，显示出明显有规律的DNA断裂，凝胶电泳呈梯状分布，DNA带间隔180bp；而sTNF-作用的L929，其DNA梯带明显较TM-TNF-的弱，而其作用的MCF-7则显出典型的细胞坏死所出现的DNA融合条带形(4b)。4两型TNF诱导的细胞死亡方式的比较(DNA梯带)Fig4. Comparison of the types of cell death induced by two forms of TNF (DNA ladder)a:DNA from target cell lines treated with the LPS-activated monocytes fixed w

19、ith paraformaldehyde1:HepG2,2:K562,3:Raji,4:HL-60,5:MCF-7,6:L929,7:Positive control b:DNA from target cell lines treated with the culture supernatant form LPS-activated monocytes1:HepG2,2:L929,3:Raji,4:K562,5:HL-60,6:MCF-7用TUNEL比较两型TNF-诱导L929凋亡效应，实验发现未加TNF-的L929偶见荧光染色；sTNF-作用的L929可见不少细胞体积明显增大，细胞膜破裂，

20、并可见坏死细胞残骸；而有的细胞荧光着色(凋亡细胞)，可见凋亡小体；TM-TNF-作用的靶细胞主要为荧光着色细胞，这些细胞体积缩小，细胞膜完整，核固缩，有的形成月牙形，有的细胞核发生断裂，被膜包绕，形成凋亡小体。该结果与DNA梯带结果一致。提示TM-TNF-与sTNF-胞毒效应时诱导靶细胞死亡方式有差异。用流式细胞仪进一步进行定量分析，结果证实sTNF-对MCF-7的胞毒作用仅表现为坏死，未见凋亡(5b)，而TM-TNF-对MCF-7的胞毒作用则主要表现为凋亡(5c)，这与DNA梯带的结果一致。对L929的胞毒作用(附表)，sTNF-引起坏死的占59.44%，凋亡为31.02%,TM-TNF-与

21、之相反，坏死仅占2.46%,凋亡则为76.13%。如附表所示，TM-TNF-对其它细胞系胞毒作用均以凋亡为主，坏死则占极少部分。5两型TNF诱导细胞死亡的FACS分析Fig5.Cell death types detected and analyzed by FACS(MCF-7)a.Controlb.sTNF M1:necrosisc.TM-TNF M1:necrosis,M2:apoptosis附表FACS分析两型TNF诱导的细胞死亡Table. Analysis of cell death induced by two forms of TNF with FACSApoptosisNec

22、rosisSecretory TransmembraneSecretoryTransmembraneMCF-70HepG2L929RajiK562HL-600讨论TNF-的杀瘤作用是最早发现的该细胞因子功能，它可杀伤若干肿瘤细胞，但对正常细胞和部分肿瘤细胞无作用。Dealtry5等发现TNF-对某些细胞的胞毒效应伴DNA断裂，Laster等6证实TNF-的胞毒作用既可引起坏死，也可引起凋亡。但以上资料反映的均是sTNF的作用。TM-TNF是sTNF的前体，表达在激活的效应细胞如单核/巨噬细胞表面。本文比较LPS刺激的单核细胞表达的跨膜型与分泌型TNF对6株细胞系的胞毒效应，证实TM-TNF比s

23、TNF具有更广的杀瘤谱，因前者可杀伤全部实验所用的细胞系，而后者则仅能杀伤其中2株。两型TNF对肿瘤细胞杀伤差异的机制可能是：(1)两型TNF激活TNFR类型的不同，因我们的实验证实sTNF仅可杀伤部分主要表达TNFR的靶细胞，而对主要表达TNFR的肿瘤细胞则无作用，TM-TNF可全部有效杀伤之(1,2,3)。最近Grell等7报道，TM-TNF可有效激活TNFR，从而参与T细胞激活、刺激胸腺细胞增生和GM-CSF产生等效应，而sTNF则不能，这与我们的结果一致。(2)在受体后水平两型TNF的作用机制亦可能不同，如PKC激活是某些细胞对分泌型TNF耐受的原因8。我们用PKC抑制剂可增强全部靶细

24、胞株对TM-TNF的敏感性，而仅能逆转HL-60和K562成为sTNF敏感株(资料待发表)，提示PKC可能涉及TM-TNF介导的胞毒作用的信号传递，而对sTNF则仅限制在某些细胞类型。我们用酸处理去除结合在单核细胞TNFR上的sTNF，可使固定后效应细胞的胞毒作用减弱(1)，提示TM-TNF与sTNF有协同作用。这可能由于：(1)sTNF通过自分泌途径作用于产生细胞自身，使之产生更多的跨膜型和分泌型TNF；(2) 同一细胞膜上的两型TNF发挥协同效应，有利于提高与靶细胞上的各型TNFR的亲合力；(3) 两型TNF在受体后水平可能也有协同作用。进一步比较两型TNF介导靶细胞的死亡方式，结果证实，

25、TM-TNF主要引起靶细胞凋亡，而sTNF则主要引起靶细胞坏死。sTNF介导靶细胞死亡方式并不一样，它可导致MCF-7细胞发生坏死，而对L929的胞毒效应既有坏死(59.44%)又有凋亡(31.02%)(4、5和附表)，但以前者占优势。sTNF引起靶细胞坏死的机制可能是：(1) sTNF的直接作用：已发现直接将sTNF通过微注射注入靶细胞可有效引起胞毒效应，这可能部分由于TNF可在脂质双层膜穿孔，因TNF可引起一种荧光染料从脂质体漏出9；(2) TNFR介导的sTNF内化对于导致靶细胞死亡是必需的10，可能内化作用不能有效激活凋亡，而主要引起坏死；(3) 磷脂酶A2(PLA2)也参与TNF的胞

26、毒效应，其机制之一可能是通过花生四烯酸代谢产物导致自由基和脂质过氧化物的产生所致。至于sTNF对L929细胞可引起两种死亡方式，其原因不清，可能该细胞系存在两种不同亚群，故对sTNF反应不一致。sTNF究竟引起靶细胞哪种死亡类型，可能取决于TNFR类型、受体后水平和细胞类型等因素。与sTNF不同，TM-TNF对所试验的各类靶细胞均导致凋亡，此效应似乎不受细胞类型和TNFR类型的限制，这不但提示TM-TNF的胞内信号传导途径与sTNF不同，而且提示TM-TNF介导不同类型靶细胞凋亡可能存在共同信号传递途径。综上所述，本实验证实TM-TNF和sTNF在胞毒效应中主要有三点差异：(1) TM-TNF

27、可有效杀伤对sTNF耐受的靶细胞；(2) TM-TNF不但可杀伤表达TNFR的靶细胞，也可杀伤表达TNFR的靶细胞，而sTNF却对后者无效；(3)TM-TNF杀伤靶细胞的主要方式是引起凋亡，而sTNF则主要引起坏死。两型TNF胞毒效应差异的机制，可能与受体结合、信号传递途径不同及其它因素相关，有待进一步探讨。志谢：感谢美国亚特兰大大学周木想教授对本课题的支持 本课题受国家自然科学基金资助(39570796)作者单位：200225 上海，东方肝胆外科研究所肿瘤免疫与基因治疗中心(石文芳)；同济医科大学免疫学教研室(李卓娅，龚非力，熊平，徐勇)参考文献1Kriegler M,Perez C,Def

28、ay K,et al.A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein:ramifications for the complex physiology of TNF.Cell,1998,5345-53.2Peck R,Brockhaus M,Rudolf F J,et al.The principal tumor necrosis factor receptor in monocyte cytotoxicity is on the effector cell,not on the t

29、arget cell. Cell Immunol,1991,132308-318.3Chomczynski P,Sacchi N Single-step method RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162156-162.4Nichletli I,Migliorati G,Pagliaci MC, et al.A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.J Immunol Method, 1991,139271-279.5Dealtry GB,Naylor MS,Fiers W,et al.DNA fragmen