PTDmFoxp3抑制小鼠皮肤移植排斥反应的研究

1、PTDmFoxp3抑制小鼠皮肤移植排斥反应的研究 11-03-24 11:26:00 编辑：studa20 作者：舒新军， 季宝菊， 蔺昕， 许逊， 田雨香 俆三荣， 邵启祥【摘要】 目的： 研究带有蛋白穿膜结构域的小鼠Foxp3融合蛋白（mouse Foxp3 fusin protein combining with transduction domain, PTDmFoxp3）对小鼠脾淋巴细胞活化增殖能力和皮肤移植排斥反应的影响。方法： 取健康C57BL/6小鼠脾淋巴细胞，在体外经刀豆蛋白A(concanavaline A, ConA)活化，并分别给予环孢素A（cyclosporine，C

2、sA）、不同浓度的PTDmFoxp3，mFoxp3，PTDGFP和培养基处理，检测脾淋巴细胞增殖指数。在此基础上进行从Balb/c小鼠到C57BL/6小鼠的皮肤移植试验，将40只C57BL/6受体小鼠随机分为4组，每组10只,分别以PTDmFoxp3，CsA，0.9%氯化钠注射液（NS），PTDGFP于手术当天开始连续腹腔注射8天为干预手段。术后第9天各组随机取2只移植小鼠，采集皮片标本，进行组织学检查。其余的8只用于观察移植皮瓣的存活时间。结果： PTDmFoxp3和CsA相似，与其他处理方法相比明显抑制ConA活化的小鼠脾淋巴细胞增殖指数（P0.05）。PTDmFoxp3组，CsA组移植物

3、的存活时间较各对照组显著延长（P0.05）；病理检查显示PTDmFoxp3组和CsA组移植物淋巴细胞浸润明显轻于各对照组。结论： PTDmFoxp3能抑制ConA活化的T淋巴细胞的增殖，且具有抑制小鼠皮肤移植排斥反应的作用。 【关键词】 小鼠Foxp3融合蛋白； 免疫抑制； 移植排斥 Abstract Objective: To investigate the potential inhibiting ability to active lymphocytes proliferation and skin allograft rejection of the fusion protein of

4、 mouse forkhead box P3 combining with protein transduction domain(PTD： The singlecell suspension of lymphocytes was prepared from mouse spleen. Polyclonal activator Con A was added to active the lymphocytes. Then the singlecell suspension of lymphocytes was incubated with different concentrations of

5、 PTDmFoxp3，PTDGFP，cyclosporine, and blank control for 48h, respectively. The bioactivity of inhibiting lymphocytes proliferation of each group was detected by incorporating of CCK8 in vitro. Allogeneic fullthickness grafts from Balb/c mice were transplanted onto the back of C57BL/6 mice. Forty C57BL

6、/6 mice were randomly divided into four groups, with each group having 10 mice and receiving a different treatment including PTDmFoxp3, cyclosporine, 0.9% physiological saline injection and PTDGFP, respectively. On the same day of the skin transplantation, the treating regents were injected into C57

7、BL/6 mice abdomen and did continuous injection for another 7 days. Two mice of each group were selected out randomly for histological observation till 9th day after skin transplantation. The survival time of other mice were observed. Results： The bioactivity of PTDmFoxp3 was similar to cyclosporine,

8、 they could inhibit cells proliferation of mouse activated lymphocytes efficiently in vitro(P0.05, comparing with blank control and PTDGFP control), they could prolong the mean survival time(MST) of skin allograft significantly(P0.05, comparing with blank control and PTDGFP control). The infiltratio

9、n of the lymphocytes in the allografts of PTDmFoxp3 treated groups and cyclosporine were reduced. Conclusion： The PTDmFoxp3 can inhibit activated mouse lymphocytes proliferation in vitro and skin allograft rejection in vivo. Key words PTDmFoxp3； immunosuppression； transplant rejection 诱导器官特异性的免疫耐受是解

10、决器官移植排斥反应的最佳方式。近年来的研究表明CD4+CD25hi调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）在维持自身免疫耐受和诱导针对外源性抗原的耐受中具有重要功能1。尽管最近有多个实验室关于Treg诱导方法的报道，但要获得足量的Treg用于临床治疗仍然十分困难。Foxp3在CD4+CD25hi Treg的发生、发育、分化和生物学功能发挥中起着关键作用。转染了Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞在体内、体外均表现了与天然CD4+CD25hi Treg十分相似的表型和生物学功能2。CD4+CD25hiT细胞中Foxp3表达下调，Treg仍能维持其免疫无能性，但其免疫抑制

11、性功能丧失，还使得CD4+T细胞更易于向Th2细胞极化，从而诱发自身免疫性疾病3。因此，维持Foxp3蛋白在CD4+T淋巴细胞内高水平表达是获取Treg的一个重要途径。尽管转染Foxp3基因方法十分直接，但存在操作复杂、基因的表达不稳定和表达调控困难等问题，而且在临床应用中存在生物安全隐患。本研究拟观察带有蛋白穿膜结构域的小鼠Foxp3融合蛋白（ mouse Foxp3 fusin protein combining with transduction domain, PTDmFoxp3）在体外对ConA活化的小鼠淋巴细胞增殖的影响，及体内应用PTDmFoxp3对实验性同种异基因小鼠皮肤移植排

12、斥反应的影响，探讨PTDmFoxp3的功能，为其应用于免疫相关性疾病的治疗奠定实验基础。 1 材料与方法 1.1 试剂和药物 环孢素A(CsA，Novartis 公司产品)；刀豆蛋白A(ConA，SigmaAldrich 公司产品)；cell counting kit8(CCK8，Dojindo Laboratories 公司产品)； RPMI1640和小牛血清（Invitrogen 公司产品）；PTDmFoxp3，PTDGFP，mFoxp3等重组融合蛋白由本实验室构建、表达、纯化4。 1.2 实验动物 清洁级6周龄Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠购自扬州大学比较医学中心，雄性，体质量18

13、20 g。动物生产许可证：SCXK（苏）2002-0009，动物使用许可证：SCXK（苏）2002-0045。均饲养于江苏大学基础医学与医学技术学院动物中心SPF级屏障环境内，饲料经辐照消毒，垫料和饮用水均高压消毒灭菌。 1.3 脾淋巴增殖反应试验 C57BL/6小鼠麻醉处死后，无菌取脾，置于盛有10%小牛血清（NCS）的RPMI1640培养液的无菌培养皿中，于200目尼龙网上轻研，将脾细胞分散成单细胞悬液。将细胞悬液移至离心管中，加入5 ml含10%NCS的RPMI1640培养液，于4 1 500 r/min离心10 min。去上清，加入0.84%NH4Cl 2 ml，37 孵育1 min裂

14、解红细胞，再用2%NCS的PBS洗涤2次，加入5 ml含10%NCS的RPMI1640培养液重悬小鼠脾淋巴细胞。于96孔板中每孔加入C57BL/6小鼠脾淋巴细胞5105，每孔加入ConA（终浓度15 g/ml），处理组分别加入CsA（终浓度1 g/ml），PTDmFoxp3（终浓度320, 640，1 280 nmol/L），PTDGFP（终浓度640 nmol/L），mFoxp3（终浓度640 nmol/L），每组均做3个复孔。用10%NCS的RPMI1640培养液补足液体，使每孔终体积为200 l。将细胞置于37 ，5% CO2培养箱中培养48 h后，按试剂盒操作说明每孔加入20 l的CC

15、K8试剂。在孵箱中继续培养3 h后，用酶联免疫分析仪，在450 nm处测定各孔光密度(D)值，并计算刺激指数（stimulation index，SI=实验孔D值/对照孔D值）。 1.4 同种异基因小鼠皮肤移植试验 以C57BL/6小鼠为受体，Balb/c小鼠为供体，进行背部皮肤移植。取Balb/c小鼠背部全厚皮片（圆形皮片直径约1 cm），刮去皮下脂肪组织，移植于去除背部皮片的C57BL/6小鼠背部，用创可贴包扎伤口，单笼饲养。于皮肤移植后第3天开始，每日观察移植皮片的颜色、硬度、有无结痂脱落及鼠毛生长情况。如果皮片颜色变灰暗、变硬，则判为移植皮片排斥开始；结痂脱落，则判为移植皮片排斥终点。

16、 1.5 皮肤移植物生存期及组织病理学检查 将移植过皮片的C57BL/6小鼠40只随机分为4组，每组10只，分别给予PTDmFoxp3 85 nmol/(kgd)，CsA 20 mg/(kgd)，NS 40 ml/(kgd)，PTDGFP 85 nmol/(kgd)。PTDmFoxp3和CsA剂量参考文献5并通过预试验确定，在上述药物剂量下能够较明显地抑制移植皮片的排斥反应。无关蛋白对照组和生理盐水对照组剂量参照实验组蛋白剂量和体积确定。各组均为手术当天开始腹腔注射给药，连续注射8天。于皮肤移植后第9天随机取2只处死，用于组织病理学检查，剩余8只用于小鼠皮肤移植物生存期观察。 1.6 统计学处理 所得数据以均数标准差(s)表示，组间差异用单因素方差分析(ANOVA);两两比较用SNKq检验；P0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 淋巴细胞增殖试验结果 经ConA活化后各组小鼠脾细胞均有增殖，但PTDmFoxp3组及CsA组脾细胞对ConA活化的增殖强度均低于对照组、PTDGFP组及mFoxp3组，差异具有统计学意义(P0.05)。随着PTDmFoxp3浓度增加，PTDmFoxp3对ConA活化的脾细胞增殖抑制强度逐渐增强，而