RPV6在人参二醇组皂苷(PDS)减轻LPS休克脑损伤中表达的变化及意义

1、RPV6在人参二醇组皂苷(PDS)减轻LPS休克脑损伤中表达的变化及意义    【摘要】     目的 通过观察人参二醇组皂苷(PDS)对TRPV6蛋白的影响，探讨PDS对LPS诱导休克时脑损伤的保护机制。方法 将大鼠随机分为对照组、LPS休克(LPS)组、地塞米松(LPS+Dex)组、PDS低剂量(LPS+PDSL)组、PDS中剂量(LPS+PDSM)组及PDS大剂量(LPS+PDSH)组。大鼠静脉注射LPS(4 mg/kg)4 h后，观察各组大鼠生存期，计算生存率，Western Blot检测大脑皮质

2、中TRPV6和Bcl2的蛋白表达。结果 与对照组相比，LPS组大鼠生存率降低达50%，脑皮质中TRPV6的蛋白表达水平明显降低，Bcl2/Bax蛋白表达的比值降低;而与LPS组相比，LPS+Dex组和LPS+PDS各组大鼠生存率增加，脑皮质中TRPV6的蛋白表达水平明显增高，Bcl2/Bax比值也增高。 结论 PDS减轻LPS诱导的脑损伤，可能与上调脑皮质中TRPV6蛋白有关。     【关键词】  脂多糖(LPS)，人参二醇组皂苷(PDS)，TRPV6，Bcl2，Bax    Protective ef

3、fect of panaxadiols against brain injury induced by LPS through upregulating TRPV6WANG Hao, ZHONG JiaTeng, LIU Ning, et al.The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China【Abstract】 Objective To explore the protective effect of panaxadiols (PDS) on brain injury induced by lipop

4、olysaccharides (LPS) and its mechanism. Methods Rats were divided into control, LPS, LPS + dexamethasone (DEX) and LPS + PDS low, middle and high dose groups randomly. Survival rate of rats in every group was calculated. The expressions of TRPV and BCL2 were detected by Western blot. Results Compare

5、d with control group, survival rate of LPS group was decreased, the expression of TRPV6 and BCL2/BAX protein ratio were decreased. Compared with LPS group, survival rates of LPS+DEX group and LPS+PDS groups were increased，and the expressions of TRPV6 protein and BCL2/BAX protein ratios were also upr

6、egulated in LPS+Dex group and all LPS+PDS groups. Conclusions The effect of PDS against brain injury induced by LPS may be related with upregulating TRPV6 protein.【Key words】 Lipopolysaccharides (LPS); Panaxadiols (PDS); TRPV6; BCL2; BAX 内毒素(endotoxin) 存在于革兰阴性细菌(G-)细胞壁外膜中,其主要生物活性成分为脂多糖(lipopolysacch

7、aride,LPS),在内毒素休克的发病机制中具有十分重要的作用。已有研究表明，神经细胞内的钙离子与颅脑损伤之间有密切关系1;钙稳态在细胞凋亡中起重要作用2。钙离子转运蛋白(Ca2+ transport protein，CaT1/TRPV6)1999年从人的小肠中克隆，属于TRPV家族，是细胞膜上调控细胞外钙离子内流的主要钙通道之一3，TRPV6的活性与细胞内钙离子浓度有关4。已有研究表明人参二醇组皂苷(PDS)能减轻LPS休克脑损伤5。本研究的目的是通过复制LPS休克大鼠模型，观察TRPV6在PDS减轻LPS诱导的脑损伤时的作用，进一步探讨LPS对中枢神经系统损伤的可能作用机制。1 材料与方

8、法1.1 实验动物分组 健康Wistar大鼠(由吉林大学白求恩医学院动物室提供)48只，体重(250±10)g，雌雄不限，随机分为6组(每组8只)：对照组、LPS休克(LPS)组、地塞米松(LPS+Dex)组、PDS低剂量(LPS+PDSL)组、PDS中剂量(LPS+PDSM)组、PDS高剂量(LPS+PDSH)组。实验方法参照文献5进行。1.2 脑皮质蛋白的提取 称取100 mg脑皮质，加入1 ml组织蛋白提取液，用电动匀浆器冰浴上充分匀浆。2 000 r/min，4离心20 min，弃沉淀，取上清。12 000 r/min，4离心10 min，上清即为总蛋白。BioRad法测定蛋

9、白含量。1.3 Western印迹检测TRPV6、Bcl2和Bax蛋白的表达 各组取蛋白25 g 与5×上样缓冲液250 mmol/L TrisHCl(pH6.8)，10%SDS，0.5%溴芬蓝，50%甘油，5%巯基乙醇混合，100变性5 min，进行SDSPAGE电泳分离蛋白质，电转移到PVDF转移膜上。PVDF膜经漂洗、封闭后各加入稀释度为1200 的兔抗TRPV6、Bcl2和Bax多克隆抗体，4，过夜。然后各加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，稀释度为1500，室温孵育2 h 。经PBST洗涤，DAB显色。用凝胶成像系统对各条带的吸光度值进行定量分析。1.4 统计学方法 结果

10、以x±s表示，采用SPSS13.0统计学软件进行分析,各组之间各项检测指标比较采用t检验。2 结 果2.1 4 h存活率 观察各组大鼠生存期并计算生存率，LPS组4 h存活率是对照组的50%(P<0.05)，LPS+Dex组是对照组的80%(P<0.05)。2.2 PDS对LPS休克脑皮质中TRPV6 蛋白变化的影响 与对照组相比，LPS组脑皮质中TRPV6的蛋白表达水平明显降低，而与LPS组相比，LPS+Dex组和LPS+PDS组脑皮质中TRPV6的蛋白表达水平明显增高，其中LPS+PDSM组明显增高，如图1。1.对照组;2.LPS组;3.LPS+DEX组;4.LPS+

11、PDSL组;5.LPS+PDSM组;6.LPS+PDSH组，下图同图1 各组大脑皮质TRPV6的蛋白表达2.3 PDS对LPS休克脑皮质中BCL2,BAX蛋白表达的影响 Western印迹结果显示，与对照组相比，LPS组脑皮质中Bcl2/Bax的比值下降;与LPS组相比，LPS+Dex组和LPS+PDS组脑皮质中，Bcl2/Bax的比值升高，其中LPS+PDS中剂量组的Bcl2/Bax比值明显增加，如图2。图2 各组脑皮质Bcl2/Bax的蛋白表达3 讨 论钙离子(Ca2+)在细胞的生命活动中具有重要作用，所有类型细胞的各种功能均不同程度地被钙离子调控。细胞内钙离子浓度处于严格的调节控制之中，

12、以维持细胞的重要生理功能。但这种巨大的钙离子浓度梯度也使细胞处于一种永恒的危险境地，易于受到许多因素的作用，从而影响钙信号调控作用，导致细胞功能异常，严重时可诱导细胞损伤或凋亡6，7。目前的研究结果表明，细胞内Ca2+浓度的稳定似乎起着更为重要的作用，不管是升高还是降低，打破这种稳态就可能导致细胞凋亡，而细胞膜钙离子通道对维持细胞内Ca2+浓度的稳定起着十分重要的作用8。研究发现Bcl2还有调节线粒体的功能，它能抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质,如细胞色素C(CytC)、凋亡诱导因子(AIF)。胞浆内质网Bcl2蛋白控制Ca2+离子流,影响胞内Ca2+重新分布,人们发现凋亡与Ca2+流从内质网进入

13、胞质有关,且Bcl2能阻断这种钙流9;Bax通过作用于线粒体而诱导细胞凋亡的Bax分布于线粒体外膜上,引起线粒体膜通透性改变及MPT孔开放,可允许相对低分子量的物质，包括Ca2+自由通过线粒体膜,引起细胞凋亡10。实验结果发现，与对照组相比，大鼠单独注射LPS 4 h后，生存率降低，TRPV6蛋白表达明显降低，这提示，大脑皮质TRPV6蛋白表达水平的降低，进而影响胞内钙离子浓度稳态，而且Bcl2/Bax蛋白表达水平的比值明显降低，不能抑制钙内流，导致细胞凋亡。与LPS组相比，LPS+Dex组和LPS+PDS组TRPV6明显升高，而且Bcl2/Bax蛋白表达水平的比值明显增高，有抑制细胞内钙内流

14、的可能，稳定细胞内钙离子浓度，从而抑制凋亡，这些与大鼠生存率增高有关。以上结果表明，LPS+PDS组和LPS+Dex组TRPV6蛋白的表达均明显高于LPS组，这可能与PDS及地塞米松对内毒素休克脑组织的具有一定的保护作用有关。    【参考文献】  1 薛 文,李守缄.创伤性脑损伤后钙超载机制的研究进展J.临床医药实践杂志 2008;17(5):3214.2 张 瑜,常 明,韩 威,等.钙激活蛋白酶与蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡的机制J.中国老年学杂志，2008;28(1):268.3 Bdding M，Flockerzi V.Ca2+Depen

15、dence of the Ca2+selective TRPV6 ChannelJ.J Biol Chem，2004;279(35):3654652.4 Nilius B,Prenen J,Hoenderop JG,et al.Fast and slow inactivation kinetics of the Ca2+ channels ECaC1 and ECaC2 (TRPV5 and 6)：role of the intracellular loop located between transmembrane segment 2 and 3J.J Biol Chem,2002;277(

16、34):308528.5 孙际童,李洪岩,苏 静,等.人参二醇组皂苷(PDS)抑制NOS和p38减轻LPS休克脑损伤J.中国病理生理杂志，2008;24(1):446.6 Hoenderop JG，Vennekens R,Muller D,et al.Function and expression of the epithelial Ca2+ channel family：comparison of mammalian ECaC1 and 2J.J Physiol 2001;537(3):74761.7 Ghoneum M，Matsuura M，Braga M,et al.Scerevisia

17、e induces apoptosis in human metastatic breast cancer cells by altering intracellular Ca2+ and the ratio of Bax and Bcl2J.Int J Oncol，2008;33(3):5339.8 Vennekens R，Hoenderop JG，Prenen J,et al.Permeation and gating properties of the novel epithelial Ca2+ channelJ.J Biol Chem,2000;275(6):39639.9 Lalier L,Car