CYP17基因多态性等位基因特异性PCR检测方法的建立

1、CYP17基因多态性等位基因特异性PCR 检测方法的建立陈巧云, 李 皓, 徐红美, 冷加燕(江苏大学附属人民医院, 江苏镇江212001摘要 目的 建立快速准确检测CYP17基因单核苷酸多态性的新方法。方法 用等位基因特异PCR (AS -PCR 方法对53例外周血标本CYP17基因单核苷酸多态性位点rs743572进行基因分型。结果 AS -PCR 测定结果与聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法(PCR -R FL P 的测定结果一致。结论 采用A S-PCR 检测CYP17基因多态性准确、快速。关键词 等位基因特异PCR; C Y P17; 多态性中图分类号 R 446文献标识码 B

2、 文章编号 1008-8849(2011 04-0485-02类固醇激素是维持人体正常生理功能的重要物质, 目前已证实有多种疾病与之相关。C Y P17基因编码的细胞色素P45017 羟化酶/17、20裂解酶是类固醇激素合成的关键酶之一, 该基因可在一定程度上决定体内性激素的水平。国内外研究发现, CY P17启动子5 上游34碱基处单核苷酸多态性位点与乳腺癌、前列腺癌等疾病的发生和发展有关1-3。因此, 检测CY P17基因型有助于激素相关疾病的早期诊断和预后判断。本研究建立了CYP17单核苷酸多态性等位基因特异PCR (A S-PCR 检测方法, 相对于传统聚合酶链反应-限制性片段长度多态

3、性(PCR -RFLP 方法有一定优势, 现报道如下。1 临床资料1 1 研究对象 53例血液标本均来门诊或住院患者, 均为镇江地区汉族人, 年龄1590(47. 12 17. 69 岁。所有患者相互间无血缘关系。1 2 试剂与仪器 T aq DNA 聚合酶等PCR 反应试剂购自Fe r mentas 公司; 引物由上海生工生物技术有限公司合成; 限制性核酸内切酶M sp A 1 购自N EB 公司; 全血基因组DNA 提取试剂盒购自大连宝生物公司; 琼脂糖和溴化乙锭(EB 均为S i gm a 公司产品; 2700型PCR 仪(B i o RAD ; DYY -6C 电泳仪(北京六一仪器厂;

4、 凝胶电泳成像系统(B i o l m ag i ng Sys te m s , UVP 公司 。1 3 方法1 3 1 模板DNA 提取 采集5mLEDTA 抗凝静脉血, 参照试剂盒说明书提取模板DNA, 并经紫外分光光度计定量后, 将DNA 浓度调到0. 11g /L,置-20 保存备用。1 3 2 多态性位点特异性引物设计 从http :/www.ncb. inl m . ni h . gov /SN P /数据库中查到CYP17基因rs743572多态性位点基因序列, 用P r i m er 5. 0软件, 设计2对特异性引物, A 1型:上游引物5'-GCCCTT C TTA

5、ATAAGC A CCTC -3,' 下游引物5-' CCACAGCTCTTCTACTCCTCT -3;'A 2型:上游引物5'-GC CCTT CTTAATAAG C A CCTC -3,' 下游引物5'-CCACAGCTCT TCTACTCCTCC -3' 。为了增加引物的特异性, 参考Kwok 等4的方法, 在下游引物3 端倒数第3位引入错配碱基(黑体标注 。1 3 3 PCR 反应体系及程序 扩增体系及程序:dd H 2O 36. 5 L , 10 PCR 缓冲液5 L, M gC l 24 L , 10mmo l/Ld NT P

6、 1 L, T aq 酶0. 5 L (5I U / L , 上、下游引物各1 L (20 m o l/L, DNA 模板1 L 。PCR 扩增条件为:94 预变性5m in ; 94 变性30s , 60 退火30s , 72 延伸30s , 共35个循环; 72 延伸10m i n 后4 保存。1 3 4 扩增产物分析 扩增产物用0. 5 TBE 电泳缓冲液配制的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳, 电泳4V /c m, 30m i n ; M arker 作为参照, 凝胶图像分析系统记录结果。1 3 5 质量控制 基因分型时做阳性对照和阴性对照。阳性对照:选择经A S -PCR 和PCR -RF

7、LP 均检测为阳性的DNA 样本; 阴性对照:用去离子灭菌水代替DNA 加入反应体系, 以防止非特异性扩增。1 3 6 方法验证 同样标本采用PCR -RFLP 测定其基因型, 其方法参照朱明明等5的研究。将结果与AS-PCR 的测定结果对照, 检测其一致性。1 4 统计学处理 应用SPSS 13. 0fo r W indo w s 软件包进行数据处理, 计数资料组间差异比较采用 2检验, P <0. 05为有显著性差异。2005, 4(4:2744 Y a m a motoM , N akaj o S, M iyos h iN, et a. l Endocri ne cell carc

8、i no m a(carci noi d of the gall b l adder J .Am J Surg Pat ho, l 1989, 13(4:292-3025 M od li n I M, Sh ap i ro M D , K idd M. An anal ys i s of rare carci noidt um ors :cl arif y i ng t h ese cli n i ca l conund rum s J.W orl d J Surg , , 6 S ternberg SS. 诊断外科病理学M.回允中, 译. 3版. 北京:北京大学医学出版社, 2003:165

9、47 M od lin I M , Lye KD, K idd M. A 5-decade ana l ysis of 13, 715carci no i d tu m orsJ.Can cer , 2003, 97(4:934-9598 N is h i ga m i T , Ya m ada M, Nakas ho K, et a. l Carci n oi d t um or of thegall b l adderJ.Intern M ed , 1996, 35(12:953-956 10485 现代中西医结合杂志Modern Journal of In tegrated Trad i

10、ti onal Chi nese and W esternM ed i ci ne 2011Feb , 20(42 结 果2 1 基因组DNA 提取 全部53份外周血标本采用试剂盒提取基因组后, 经紫外分光光度计检测, OD260/OD280均大于1. 6, 表明DNA 纯度符合后续实验要求。2 2 等位基因特异PCR 分型结果53份标本均扩增出片段, 其中仅A1型引物有扩增条带的为A 1/A1型, 见图1第2, 3泳道; 仅A 2型引物有扩增条带的为A 2/A2型, 见图1第4, 5泳道; A 1A2型引物均有扩增条带的为A 1/A2型, 见图1第6, 7 泳道。图1 CYP17基因型AS

11、-PCR 检测结果2 3 A S-PCR 方法和PCR -RFLP 方法的比较 每份血液标本均经过2种方法检测, 检测结果显示二者完全一致, 说明此2种方法的灵敏度和特异性相同。3 讨 论CYP17是类固醇激素代谢的关键酶之一。C Y P17是P450超家族的成员之一, 编码细胞色素CYP17 酶, 具有调节类固醇17 羟化酶和17, 20裂解酶活性的功能, 被认为是雌激素代谢过程中的关键酶。CYP17基因位于染色体10q24. 3, 在翻译启始点上游的34bp 处, 由于单个碱基的替换产生了M sp A lI 的酶切位点, 该替换还使得CYP175 区增加一个Sp-1型(CCACC 启动子位

12、点, 有可能增加CYP17基因的转录, 理论上该多态性可影响体内雌激素水平, 可能影响许多雌激素相关疾病的发生与发展, 被认为是激素依赖性肿瘤和疾病的候选致病基因。Fe i g elson 等6研究了CYP 17基因多态性对女性体内性激素水平的影响, 发现A 2等位基因的出现可以增加乳癌发生的危险性。由于A 2等位基因同样可以增加雄激素的合成, 许多学者对其与前列腺癌的发生关系进行了研究。Lunn 等7发现携带A 2等位基因的白人发生前列腺癌的危险性显著增加。G sur 等8也发现在A 2/A2基因型人群中发生前列腺癌的危险性明显增加, 提示A 2等位基因可能与欧美国家的前列腺癌的发生有着密切

13、关系。朱明明等5发现, CY P17M sp A lI 位点A2/A2基因型可以增加女性HBV 感染个体患HCC 的风险, 该位点多态性可能是HBV 感染个体发展为肝细胞癌的重要机制之一。因此, 对患者C Y P17基因型进行检测具有重大的临床意义。目前, 采用最多的分型方法是PCR -RFLP 法, 主要基于之处: 耗时长。为了保证完全酶切, 酶切时间一般长达数小时或过夜, 不能及时获得检测结果。 影响因素多。特别是酶切过程中, 如果温度或离子强度控制不好, 就会影响到酶切的结果。不完全酶切会导致A1/A2型的假阳性增加。 费用高。内切酶M spA lI 的价格比较高, 大样本的实验如采用P

14、CR -RFLP 方法, 将会增加成本。本研究建立的AS -PCR 方法基本上可以解决上述问题。每份标本采用2管PCR, 同时进行检测, 省掉酶切的过程, 电泳结果直接判断基因型, 大大节省了时间; 在某些情况下, 即使引物的3 末端碱基与模板不配对, 延伸仍然可以进行, 只是延伸效率仅有前者的10-610-3倍。因此, 与3 末端碱基和模板正确匹配(Ma tch 的引物相比, 3 末端碱基与模板碱基不匹配的引物仍有较低的延伸效率, 并且不同的3端错配(Mis m atch 有不同的延伸效率, 因而引物3末端一个碱基的错配不能总是很可靠地区分2个等位基因。H ayash i 等9发现, 在引物

15、3 末端倒数第3位引入T /G或C /A类型的替换能显著地提高引物的特异性, 本研究根据此结论, 在下游引物的3 端倒数第3位碱基人为引进突变, 避免了非特异扩增的发生; 本方法不需要限制性核酸内切酶, 相对于PCR -RFLP 方法更加经济。总之, 本研究建立了一种快速简便检测C Y P17单核苷酸多态性的方法, 对基层医院具有一定的借鉴意义。参考文献1 T z ner BM, Ozt rk T , K isakesen H I , et a. l CYP17(T-34C andCYP19(Trp39A rg pol ymorph i s m s and t h ei r cooperati

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