western blot实验步骤

1、western-blot 实验步骤Western bolt一、实验目的通过实验了解western blot技术的原理和操作。二、实验原理SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度 检测和测定蛋白质分子量。PAGE能有效的分离蛋白质，主要依据其分子量和电 荷的差异,而SDS-PAG的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS（十二烷基 硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的

2、大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽 可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和 分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX式中：MW为分子量，X为 迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数 作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电 泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane，简称NC膜），在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。 NC膜是生物学试验 中最重要的耗材之一。第一抗体就是能和特异性抗原特

3、异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结 合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为 ECL试剂）是目 前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的 A液主要成分为鲁米诺（Luminol ）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有 HRP （辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。三、实验器材1. 电泳槽，胶板架子2. 转膜仪3. NC 膜4. 电泳电源5. 滤纸6摇床7. X射线摄影暗匣8. X射线胶片9. 塑料薄膜四、实验试剂1.r unnin gbuffer 5xrunnin gbuffer(

4、IL) Tris15.1gGlyc ine SDS ddH2O 使用前稀释2. Tra nsfer buffer 10X Tran sfer buffer(1L) Tris Glyc ine ddH2O 使用前稀释3. TBS 10X TBS(500mL) Tris Nacl ddH2O94.0g5.0g定容至1L30.3g144.0g定容至1L加入1/4体积的甲醇10倍,12.1g40.0g定容至500mL pH值至7.6用HCI调节溶液的4. TBST(1L)1 X TBS:Twee n-20=1000:1 ddH2O定容至1L 5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml) 脱脂奶粉2.5gTBST

5、6. 一抗溶液7. 二抗溶液8. 显影液现配现用，溶液 A:溶液B=1:1配置。9.SDS-PAGE(配方见下一页)五、操作步骤定容至50ml1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.1SDS-PAGE胶的配置 先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。 准备好试剂。 计算所需要使用试剂的量。例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要 7ml，10块胶，共需要70ml 将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板 有正反之分，上面的“ up”朝上。 准备配胶按照上面配方依次添加。 注意：1.添加量少的试剂要注意混匀2.TEMED ，APS要最后力卩 配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中

6、。注意速度不能太慢，否则胶液会凝， 越是浓度咼的胶液凝的越快。 分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面，注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。 半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。 凝结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。3ml。 配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约 注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子 的时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。A.分离胶6%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.853.994.5

7、65.740%Acr/bis0.751.051.21.51.5Mtris-HCl（ pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0040.00560.00640.0088%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.63.644.165.240%Acr/bis11.41.621.5Mtris-H1.31.822.082.6Cl (pH8.8)10%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0030.00420.00480.0061

8、0%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.353.293.764.740%Acr/bis1.251.7522.51.5Mtris-HCl (pH8.8)1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00412%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.12.943.363.340%Acr/bi1.52.12.44.0s1.5Mtris-HCl (pH8.8)1.31.822.082.510%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.07

9、0.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00415%GEL5ml7ml8ml10mlH2O1.7252.4152.763.4540%Acr/bis1.8752.62533.751.5Mtris-HCl (pH8.8)1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.004B.浓缩胶5%GEL2.02ml4.04ml6ml10mlH2O1.482.964.443.440%Acr/bis0.250.500.750.831.0Mtris-HCl（ pH6.8

10、）0.250.500.750.6310%SDS0.020.040.060.0510%AP （过硫酸铵）0.020.040.060.05TEMED0.0020.0040.0060.0051.2凝胶电泳 将电泳槽和胶板架子用去离子水清洗干净，把事先准备好的胶板和电泳槽与胶板架子组装好。注意：胶板较短的一侧朝内。 往电泳槽内注入running buffer，如果胶板架子和胶板组装的不是很严密需要 将running buffer加超过上样孔，但也不要漫过胶板最上方。 根据自己需求上样。 盖上电泳槽的盖子，注意电极的正负。插上电源，打开电源，设置时间和电压。一般需要设置两次时间，浓缩胶100V, 0.5

11、h;分离胶要根据分离胶的浓度和实验的需求而定。分离胶浓度越低，蛋白样跑的越快。 开始电泳。2. 转膜（半干转） 转一张膜需准备2张比分离胶部分略大的滤纸和1张与滤纸相同大小的NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。在转膜前要将NC膜先放在去离子水中浸泡几分钟，因为直接将NC膜泡在Transferring buffer中会导致NC膜变的很皱。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里， 要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。 若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。） 在加有Transferring buffer的搪瓷盘里放入

12、转膜用的夹子、一支试管、滤 纸和浸过的膜。 将转膜仪打开，在上面垫浸泡过的滤纸，用试管取一些Transferring buffer轻轻倒在上面，再用试管来回擀几遍以擀走里面的气泡。 在滤纸上摆放好NC膜,注意膜的中间先与滤纸接触，然后两边慢慢放下。 将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。 记住正反面，切去一角已标记方向。 小心剥下分离胶去离子水中清洗掉上面的废胶，后用手拿着胶的轻轻置于NC 膜上，注意胶的中间要先与NC膜接触

13、，然后慢慢放下，以防有气泡。用手调整 使其与NC膜对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。 在最上面铺上最后一层滤纸。 用纸吸取多余的Transferring buffer 。 盖上转膜仪的盖子，插上电源，打开电源，设置时间和电压，25V, 45min。3. 免疫反应用同样的方法剪去一个角，标 10分钟/次，倒去TBS液。1. 取出NC膜于，用剪刀减去多余的NC膜部分， 记正反。将NC膜置于TBS中在摇床上摇3次，2. 封闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。3. 抗（1: 10000）孵育4C过夜。15min。4. 取出NC膜，用TBST在摇床上洗三次，每次5. 圭寸闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。6用同样的方法，二抗（1: 10000）孵育，1h。7.取出NC膜，用TBST洗三次，每次15min。4.显影取两张塑料膜，剪成比膜大的相同的大小。将其中一张铺在X射线摄影暗匣 里。 按照1: 1配制好显影液，混匀。 将NC膜平铺在第一张塑料膜上，将显影液均匀的铺在 NC膜上,左右摇晃X射 线摄影暗匣使显影液尽量铺满 NC膜。 将第二张塑料膜从左到右或从上到下铺在最上面，用胶布