基因定点突变全攻略

1、基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基 二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应（P CR）等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒 ）中引入所需变化 （通常就是表征有利方向得变化） ，包括碱基得添加、 删除、 点突变等。定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。也就是实验体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具,室中改造 /优化基因常用得手段。 蛋白质得结构决定其功能 ，二者之间得关系就是蛋白质组研 究得重点之一。对某个已知基因得特定碱基进行定点改变

2、、缺失或者插入， 可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构, 对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功 能得关系 ，探讨蛋白质得结构 /结构域。 而利用定点突变技术改造基因： 比如野生型得绿色荧 光蛋白（wtGFP）就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光，经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造，现在得GFP能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移）,而且发光强度比 原来强上百倍 ， 甚至还出现了黄色荧光蛋白 ， 蓝色荧光蛋白等等。 定点突变技术得潜在应用领 域很广，比如研究蛋白质相互作用位点得结构、 改造酶得不同活性或者动力学特性 ，改造启动 子或者DNM乍用元件，提高蛋白得抗原性

3、或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面通过设计引物，并利用P CR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来得就就是我们得 PCR 产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复 突变引物设计得特殊原则 :（1 ）通常引物长度为 2 5 4 5 bp,我们建议引物长度为 3 0 35 bp。一般都就是以要突 变得碱基为中心，加上两边得一段序列，两边长度至少为11 12 b P。若两边引物太短了， 很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要1 1-1 2个b P才能与模板搭上，而这种突变

4、PC R要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补得引物。（2）如果设定得引物长度为30 bp ,接下来需要计算引物得Tm值，瞧就是否达到78C（G C含量应大于40%）。（3）如果Tm值低于7 8C ,则适当改变引物得长度以使其Tm值达到7 8C （G C含量应大于40 %）。）设计上下游引物时确保突变点在引物得中央位置 . 最好使用经过纯化得引物。T m值计算公式：Tm=0 41 X （ % of GC） - 675/L+81、5注：L:引物碱基数； 0 f G C :引物GC含量.四、引物设计实例以GC 3 ACG为例:5/ CCTCCTT CAG T

5、ATGTAGCGC TTACTT AT TGCGG3'(1)首先设计30 bp长得上下游引物，并将 A (T )设计在引物得中央位置.Primer #1:5 ' CCT T C AG TATG TA GAC GA CTTACT AT TTG C3 'Primer 2: 5 ' GCAATA AGTA AGT CG TCTACA TACTGAGA G3'(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入 Tm值计算公式，得到其 Tm=7 5、5 (Tm=0 41 X 40-675/30+8 1、5)。通过计算可以瞧出其 Tm低于78C,这样得引物就是不

6、 合适得 ，所以必须调整引物长度( 3)重新调整引物长度Primer 1:5' - CC TC CT TCAG TATGTA G A CG AC TTACTTATTGGCG- 3 'Pr ime r #2: 5 ' C CGCAATAGTAAGTCGCTA CAT ACTGAGG AGG-3'在引物两端加5me r(斜体下划线处)，这样引物得 GC含量为45、7%,L值为35,将这两 个数值带入 Tm值计算公式，得到其Tm为80、952(T m =0、41 X 47、5- 67 5 / 3 5+81、5 ), 这样得引物就可以用于突变实验了 .五、突变所用聚合酶

7、及Buffe r引物与质粒都准备好后，当然就就是做PCR喽,不过对于PC R得酶与buf fer，不能用平时得，我们做PC R把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个 K,所以要用那些G C buf f e r或扩增长片段得bu f f er,另外，要用保真性能较好得PFU酶来扩增，防止引进新得突变。除了使用基因定点突变试剂盒，如Stra t agene与塞百盛得试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真得聚合酶，如博大泰克得金牌快速ta q酶、T akara得Pr imeSTARM H S D NA P ol ymeras e。六、如何去掉 PC R产物最简单得方法就就是用Dpnl酶，Dpnl能够识别甲基

8、化位点并将其酶切，我们用得模板而PCR产物都就是没有甲基化得，所以D pni酶能够特异 PCR产物，从而去掉模板留下 PCR产物，所以提质粒时那些, 最少一个小时吧 ,最好能有两三个小时， 因为如果模板处 模板直接在平板上长出来 ,就会导致实验失败 .一般都就是双链超螺旋质粒 ， 从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来(除非您 用得就是甲基化缺陷型得菌株) ， 性地切割模板(质粒)而不会影响 菌株一定不能就是甲基化缺陷株Dpnl 处理得时间最好长一点 理得不干净 ， 哪怕只有那么一点点，七、如何拿到质粒直接把通过Dpnl处理得PCR产物拿去做转化就行了 ，然后再筛选出阳性克隆，并提出质

9、 粒， 拿去测序 ，验证突变结果。八、图示1、设计点突变引物.5怕 P 1. Inducina muToTion PS宙中甘Im USng Mulo-cHrectStep2. Seledion Using MutarymStp 3, Tro nwf Of matton Using comoatant ogI NicJf recovering)Mut ad i recA:诱导突变基因（P CR反应）以待突变得质粒为模板，用设计得引物及 t ?酶进行PC R扩增反应，诱导目得基因突变.3、4、注参考引物设计指导2、准备模板质粒DN A注用dam型菌株（例如DHa菌株）作为宿主菌。在en d*型菌株

10、中常有克隆数低得现象 但就是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司得质粒提纯试剂盒。选项对照反应体系（5 0卩1反应体系）10X Rea ctio n B u ff e r511pU Cl 8 c on t r o l pl asm i d( 1 0 n g2il/jil, to t al 2 0ng)Co ntr o l pri me r mix( 2 0p mol/ 11)2 11dN TP m ixtu r e (each 2 .5mM)2 11d H2O3 8 11Mut a -dir ec t? En zym e1 11样品反应体系（5 0卩1反应体系）10X Re

11、action Buff e rSam pie p lasmid( 1 On g/ 卩 l , total20n g )2 jilSamp le pr l mer ( F)( 1 Opmol/卩l )1 i1Sample prime r (R ) ( 10 pmo 1 /卩l )1lldN TP mixt u re( e ach 2。5mM)2 ildHkO38 i1Muta -direc t ? Enzyme1 i16、4个时5、PC R反应条件注按如下参数设置P CR扩增条件。Cycle sTemp erat u reRea Ct i o n Time1 c ycle9 5 C3 0 se

12、c15c y c le9 5C30se c55 C1mi n72 C1mi n per pl a smid K bP CR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温(避免反复冻融)。注 按下列提供得P CR条件进行扩增，控制 PCR循环数。注意当突变点位点超过 会发生突变率降低得现象。:B突变质粒选择PCR反应结束后使用 Muta zyme赠消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA.1、 准备PCR反应产物2、 加入1卩I ( 10U /卩1 )Mutazy me ?酶3 7C温育1小时.注当质粒DNA用量过多时Mu tazyme?酶可能发生与样品反应不完全得现象。因此我们建 议为了保证突变率请严格遵

13、照实验步骤进行操作.如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazy me酶用量。:C转化反应完毕后在质粒 DNA上会产生缺口，当把这个质粒 DNA转入E、c ol i中时请选择dam 型菌株，例如DHa。将10卩1样品加到5 0卩1感受态细胞里，然后放置在冰上3 0分钟。 2、接下来可以参照一般得转化步骤进行.序列分析 通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。先讲最简单得一个点得定点突变技术 ，其它较长片段得突变，删除,插入技术以后会慢慢 奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验得目得与实验得原理。 ？ 实验得目得应该 比较明确吧：

14、就就是要把自己得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会第一:我们吊出来得基因有点突变，相信这可能就是大家经常会遇到得问题。基因好不容易 吊出来，并装进了自己得载体，却发现有一两个碱基跟自己得预期序列或所有得公共数据库 不匹配，然后暴昏。大家实验室里面还就是用Ta q酶为主吧，Pfu这样得高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶得优点与缺点都很明显：优点就就是扩增效能强，缺点就就是保真性差，其错配机率就是比较高得，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字 ，不过感觉如果就是 20 0 0bp得基因，如果扩四五十个循环得话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里得Buf fer有

15、很大关系，详细情况这里就不讨论了。第二:要研究基因得功能，在基因上自己选定位置更换碱基得保守序列，或者改造成不同得亚型，总之就就是要人工改造碱基序列符合自己得实验需要，相信这也就是那些研究基因得人 经常得一种思路吧。对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配得位置就是不就是重要得位置有几种可能使我们需要这样去做:，如果 不就是很重要，大可不必管它，比如说就是三联密码子得最后一位，碱基得改变并没有引起相应氨基酸得改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类得基因得版本一直在变化，也就就是说同一个基因有不同得版本，或者称不同得亚型，其碱基序列有些许得差 异，只要自己克隆出来得碱基序

16、列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果 有时间没钱，那干脆重新PC R然后再克隆进自己得载体了， 不过最好换个保真性好一点得酶 如PF U，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦.实在不行得话再来做定点突变.？对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了.接下来开始聊一聊定点突变得原理吧，那个Str at age ne试剂盒！上面有一个说明书，瞧都不瞧，我们简明扼,然后去掉模板，剩下来得,然后再转化，筛选阳性克说得好像很正规，不过上面好多都就是什么专利啊什么注意之类得话， 要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PC R将模板扩增出来就就是我们得P CR产物,

17、在P CR产物上就已经把这个点变过来了 隆，再测序确定就行了。 大家马上就会想到几个问题了 ：？第一:引物怎么设计呢？?第二:模板怎么去掉呢？ ？第三：怎么拿到质粒呢？ 对于第一个问题：怎么设计引物 ？我只能讲一些原则，并举一些例子。引物设计得原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了:不过这种突变引物要加上一个原则：般都就是以要突变得碱基为中心，加上两边得 一段序列，两边长度至少为1 1 12b a s e p a ir。？若两边引物太短了 ，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11 12个base p ai r才能与模板搭上，而这种突变P CF要求两边都能与引物搭上，所以两边最好

18、各设至少12个bas e pai r,并且合成多一条反向互补得引物。这么说大家可能不就是很清楚 ， 那我就举个例子吧 ：X 71 6 61、 1 TA TCAG GA GGAATTTGAC ACTTT： AA CAAG AATTGGAJ AA AAA AAAG AGG AATTCCG 9 60?现有序列 T ATCAGGAGGAATTTGCAC TTTC AA CAA GAA TTG GAT AAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924?* * * * * * * * * * * * * * ?| - deletionX7166 1 、1 AAGG GCC ACCCCGACCTCCAAG

19、AGGCC TGCG GA GGAAA TATTTGAGAGTGATGG AGA T 1 020现有序列 AAGG GC CAC CCC GACCTCCAAGGGCA GCC TG CG GAGGAAATAT TTGAGAGTGTAGGAA T 9 8 4 （上面为目得序列，下面为现有序列：我们发现有一个 A碱基得缺失， 其直接结果就是在表达蛋白时后面得氨基酸全部错配）我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多得 A造成引物GC含量过低，故拉长引物使G C%含量不至过低，也使引物退火温度升高。故合成引物 CAACA AGAATTGGATAAAA AA AAAGAGGATAT

20、 C CAGAGA 并合成反向互补引物 CTTCTGGA ATTCCT CTTTTTTTT TATCC AATT CTTGTTG其实也不一定要反向互补序列， 只要反向引物也就是两边都有大于 12个碱基 ，同时符 合引物设计得原则就行了 .引物合成公司有很多家 ，大家可以去寻找 ，不同厂家得引物在价钱质量上有一些差别 不过价钱一般都就是一块多一个碱基 ， 合成时间约为一周 .PCR产物就是一条链完整,另这样得结果就是PCR时把整个质粒都给扩出来了 ，得到得一链有缺刻得 P CR产物Dp nI酶，Dp nl能够识别, 从大肠杆菌里提出来得），而PCR产物都就是对于第二个问题 ： ? 怎么去掉模板呢

21、 ?再简单得方法就就是用甲基化位点并将其酶切，我们用得模板一般都就是双链超螺旋质粒 质粒一般都被甲基化保护起来 （ 除非您用得就是甲基化缺陷型得菌株 没有甲基化得，所以Dp n I酶能够特异性地切割模板 （质粒）而不会影响PC R产物,从而去 掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能就是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。关于第三个问题：直接把通过Dpn I处理得PCR产物拿去做转化就行了 ，呵呵，然后 再筛选出阳性克隆 ，并提出质粒 ，拿去测序 （这个就不用我多说了吧） ， 验证突变结果 ，一般都 没问题得啦 ， 我做了几十个突变了 ， 到目前为止还没有做不出来得，呵呵，不要砸我啊

22、。 下面讲一下具体得实验步骤以及一些实验中要注意得事情 ： 1?、 根据现有基因设计引物 ； 合成引物并准备好模板；PCR ,Dpn I处理酶切产物；2、3、4、5、转化酶切产物；6?、筛选阳性克隆；？7、送测序并测全长.？最后就就是庆祝啦，呵呵, 没什么复杂得。引物与质粒都准备好后，当然就就是做PCF喽,不过对于 PCR得酶与buf f e r,不能 用平时得，我们做PC R把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个 K,所以要用那些GCbu ffer或扩增长片段得buffer，另外，要用保真性能较好得PFU酶来扩增，防止引进新得突变。K it标准点突变试剂盒 长模板单点突变试剂盒（ 后面用了比较适

23、合长片段那种Qu i c k c h ang e试剂盒分为几种不同得类型什么Qu i k Cha nge? Si teD irected Mutag e n e si s Quik Chan ge? XL Site -Direc t ed M u tage nesis Kit 8k b）从原理上就是一样得，只就是PCR得酶与BUFFE R不一样，扩增得酶与B UFF ER罢了 ,没什么特别得东西。另外，D pni处理得时间最好长一点，最少 一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板 直接在平板上长出来，就会导致实验失败.实验板长出来得菌有两种可能种就是质

24、粒DPNI没处理干净长出来得（模板）,一种就是P CR产物转化出来得（突变体）不过这两种菌长得一模一样 A A,即使提出质粒来也就是一样（酶切与PCR都无法区分），除 了测序，就是分不出来得，做PCR时也最好做一个负对照（不加引物）,实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有 PCR产物，而对照管 由于PCR时没放引物，所以在DP NI处理前里面只有模板。 ？如果两者都拿去 DNPI处理?就 能够证明模板已经被去除干净 .若实验顺利得话应该就是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就就是Dpnl没处理好，如果正负对照都不长菌,那么有两种可能,一种就是P

25、CR阴性,也就就是说PCR出问题了，另 外一个可能就就是转化出问题了。要搞清楚就是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化得对照，拿试剂盒得对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就就是DPN I处理得不干净，这个时候就得靠运气了八人 大家有什么问题我们可以继续讨论.另外，如果大家既没有 Dpnl酶也没有好得 PCR酶与B UFFER得话，那也有其它办法进行定 点突变，只就是麻烦一点，如果大家有需要得话 ，我会把方法贴上来。？对于多点突变技术及 较长片段得缺失插入技术，同样得，如果大家有需要得话，我会把方法贴上来。不过,如果您有钱得话，那就去买那个试

26、剂盒吧，其中Qu ik Ch an ge? Si t eD irect e d Mutag e n e s i s Ki t 标准点突变试剂盒、Q uikC h an g e? XL Site-Direct ed Mu t a g e nesis Ki t长模板单点突变试剂盒 （ 8 kb ）得原理我上面已经说了，只就是 补充了一些我认为得注意事项。如果您更有钱得话，那么您可以叫其它公司帮您做定点突变服务,大约就是改一个点100 0元左右。如果有需要我可以提供公司得联系方式。下面我以一个例子为例来讲100个bp以下得碱基插入缺失或者改变实验方案.其实这种方案并不就是那么好得，只不过考虑到大家一

27、般都没有TYPE II限制性内切酶或者 UD首先先说明一点 , 这G and N THI II（ 另外两种方法） ,所以才打算先介绍这种方法种 方法在原理上存在一定成功机率，也就就是说有运气成分。而定点突变则一般都就是百 分之百成功得， 而这种 100bp 以下得插入缺失或者碱基改变可能要测几个克隆才能挑到一个 好得克隆 , 大家如果要用请慎重考虑同样得，我只变那几十个碱基 , 并没有改变载体及其它地方 , 所以我还就是依赖于DPNI 酶.举例 :MRDP色 A APHo mo s ap i e ns FzE3就是一个人类基因，其含有32个氨基酸得信号肽LSS LGLCALVL ALLGA L

28、S AG AGA 后面就是成熟肽 QPYHG医 GI SVP DHCT CQ PISI PLCT DIAYNQTL PNL LGHIN QEDAGLE VHQRf PL VKVQCS PELRFFLCSM P VCTV LDQA IP P CRSLC ERA RQCE ALM NKFGQW P ERLFC ENF P VHGAGEI VG QNTSDG GGPGGGPTAYTAPYL PDL PFTA LPPGA SDG< GFP AFPFSP RQLKV PPYLG YFF LGERDCGA PCERQANGLMYK EEE RFF ARLWVGVWSVLCTAFTVLT YL VDM

29、RRFSYERPIIFLSGCY FMV AVA HV AGFLL EDRACV ER FSD DGY RT VAQ GTKKEGCTLFM也 YFF GM ASSIW WVIL SLT?WFL AAG MKWG EA I E ANSCYF HLAA WAVPV KTITILA MG QVD GD LLSGVCYVGLSSDALR GFVLAPL FV YL FIGTSFLL AGFVSLFRIRTIMM DGTKT EKL EKL MVI GVFSLY TVPATIVLACYFYEQAFRE HWERT WLLQTCKYSAVPCPPGHFPPMPSDFTVFMKI YLMTMIVGITTG

30、 FWIVSG KTL QSWRRFYRLSHSSG ET AV,想在信号肽与成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一个Leucin e。即在信号肽与成熟肽之间插入一段序列：T TAATGGAC TACAAA GACGATGACGCAA AG（ 一共三十个 bp）、实验设计 :信号肽 :AT GCGGGACCCC GGC G CG GCCGTCT C GCT TTCGTCCTCGGG CTTCTGGTC CCTGGTGCTG?GCGTC GCTGGGCGCTACGTCCGCGGGCGC CGGG GCG成熟肽 :CAGCGC TACCAC GGA GAGAGA GGCATCTCCGTG

31、CCG GACCACGGC TT CT GCCAGCCCATTCCA TCC CGCGT TGCACGGACATC?GCCTA CA AC CA GACCTA CCTG CC CAACCTGC TGGG CCACCA GAACCAAGAAGGC GC GGGCCTC GAGGTGACCC AGTT CTAC CCGCT GGTG AAGG TGC AGT GTTCT CC CGAA CTCCCG TTT?TTCTTA TGC TCC ATG TAT GCG CCCGGT TGCACC GTGCTC GA TCAGGCC ATCCCGCCTGGTCGTTCTC TGT GCGGA CGC GCC

32、 CGCAC GGGC TG CGAGG CGCTAC T GAAC AAGTTCGG CT TC?CAGTGGCCCGAGCGCCTGTCGCGAGAACTTCCCGGGTC ACGGTGGCGGC GAGATCTGCGTG GGCCAAGA CACGT CG GACG GCT CCGG GGGCCCAGGCGGGCGGCCCATC G CCTACCC TACCGC GCCCT AC CTGC CGGAC CTGCCCTTCACCGCGGCTCCCCGGGGGC CTCAGATGGC?AAGGGGCGTCCCTGTCCCCCCT TCTCATGCCCCC GTCAGTCC AAG GTG C

33、CCC CGTAC CTGGG CTACCGCT CCT GG TGAGCGCG密TGTGGCQCCCGT GC GAACCGGGCCGTGCCAACCCTGATGACTTT AAGGAGGAGkG AGGCGCTCGC CGCCTCTGGTGG CG TGTGTCCGTG TGT GC TG CGC TC GACGCT TTT ACCG TTCTCACGTACCTGG 不GGATGCGGC GCTTCA GCIAC CCAGAGCGGCCCATT CTTCC TGTC GGG CTGC TACTTC AT GG TGGCCGTG GCGCC GT GGCCGGCTTCTTTCTAGGAC C

34、G(G CC GTGTG CGTGA GCGT TCTC GGACGAGT GCTACCGACCG GTGGC GC AGGCG AC CAAGAA AGAGGGCTAG CCA T CCTCTTCA TGG TG CTCTACTTTCTCGG CAT GGCCAGC TCCATCT GGTGGGTCATT CT GTCTC TCACTTGGT TCC TGGC G GCCGCGATGAAATGGGGC CACGAAGCCATCGAGGCCAAC TCGCAGTACTT CCACC TGGCGC CGT GGG CCGTGCCGCCCGTCAAGACCA TCACTATCCTGCGC ATG

35、GG CCAGGTAGACGGGGAC CTGCTGAACGGGGTGGTCTACGTTGGCTTCTCCAGTGTGGACGCG ?CTGCGGGGCTTCGTGTCGG CG CCTCTGTT C G TCT A CT TCTTCAT A GG CACGT CCTTCTTG?CTGGCCGGCTTTCGTCC TTCTTCCG TATC CGC ACCA TC ATG AAACAC GACGGCCACA AGACCGA GAAGCTGGA GAAGTC CATGGTGCGCAGTCGCGTCTT CA GCGTG CTCTA CACA GTGCCCGC CACCACT GT CCT GG

36、CCT GCT ACTT CTACGAGCAGGTCTCCCG CGAGC ACTGG GAGCG CACCTGG CT CC TGCAGAGCTGCAAGGACT AT GCC GTGCC CTGCCCGCCCGCGACTT C?CCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTTCGTATCTACAAGTGCCTGGATA CCATGACT GT CGGCATCACCACTCGTGTCTGGATCTTGGCG GGCAAGACCCTG CA GTCG TGG CGCCG CTT CTACCA CAGAC TTAGCCCAAGCAGCAAGGGAAGACGC G CGGAT TGA插入序列

37、 ?TT AA TG GA CTA CAA AGACGATGGACACAAG ?通过引物 3端大于或等于 18个碱基得匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物得序列来补上那三十个碱基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面这两条引物把整个质粒给扩增出来 ,上游与下游引物就刚好把那三十个碱基给补上了 ,再参照引物得设计原则做一 些润色，细心得朋友可以具体分析一下这两条引物.扩出来后再用DP NI酶把模板质粒去掉CR产物得两端连接起来（虽然就是平端连接，可就是由于就是同一条 PCR ,效率会很高），转化后，测序验证，O K.再用连接酶把P产物得两端连接5端设计引物for W a r d pr imer: G GACTACAAAGCAGATGAC GAC AAGCA GCCGTACCGACG AGAGAAG88、 5?r e s e rv