一种简便的非放射性原位杂交法检测胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA

1、一种简便的非放射性原位杂交法检测胰腺型弹性蛋白酶mRNA【摘要】目的检测大鼠组织中胰腺型弹性蛋白酶mRNA的表达。方法根据大鼠胰腺型弹性蛋白酶基因序列合成两端含有相邻胸腺嘧啶结构的单链DNA探针，完成杂交后利用抗胸腺嘧啶二聚体抗体与抗原化的单链DNA探针进行反应，再运用免疫组织化学方法从而检出组织中目标mRNA的表达。结果大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色，其他的组织细胞均显示阴性。结论本试验中采用的原位杂交方法操作简便安全、无放射性，并且具有很高的灵敏度和特异性。实验结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性表达胰腺型弹性蛋白酶mRNA，而其他组织细胞不表达。【关键词】胸腺嘧啶二聚体；原

2、位杂交；非放射性；弹性蛋白酶；mRNAAbstract：ObjectiveTodetecttheratpancreaticelastaseIImRNAinrats.MethodsISHwaspreformedbyusingOligo-DNAprobebasedonthesequenceofratpancreaticelastaseIImRNA,which3and5terminalconjugatedwith-A-T-Tstructure.Theanti-T-TIgGantibodywasusedtoreactwithhaptenizedOligo-DNAinimmunohistochemica

3、lprocess.ResultsAcinarcellsinratpancreaswerehighlylabeledspecificallybytheprobe.ConclusionItwasa*andsafetyISHmethodwithhighsensitivityandspecificity.TheacinarcellsinratpancreasexpressedpancreaticelastasemRNAspecifically.Keywords:Thymine-Thyminedimer；ISH；non-radio；elastase；mRNA常常用的检测细胞基因表达的技术，已经发展出了很

4、多方法，其中由小路武彦等学者利用胸腺嘧啶二聚体（thymine-thyminedimer，T-Tdimer）特性近年来发展出一种无放射性原位杂交方法1，在此采用这种方法检测对大鼠组织中胰腺型弹性蛋白酶mRNA2的表达进行检测。1原理在生物细胞中有许多含有相邻胸腺嘧啶（thymine）序列的基因片段，当受到紫外线（包括阳光）照射时，任何两个相邻的胸腺嘧啶之间会形成共价键结构（即胸腺嘧啶二聚体），从而造成DN*段的损伤。但由于T-Tdimer具有半抗原的特性，所以可以利用这个特性而应用于ISH。当我们需要检测组织细胞中任何一段mRNA的表达时，可以设计并合成一段单链DNA引物（注意避免其中含有T-

5、T构造），并在目标cDNA的两端链接上含有T-T构造的序列作为单链DNA探针。进行ISH时，用适当剂量的紫外光照射，使探针两端形成T-Tdimer，将探针与mRNA杂交后，再使用抗T-Tdimer的抗体与探针进行反应，那么运用简单的免疫组织化学技术即可检出组织细胞中目标mRNA的表达。2方法2.1DNA探针的制备合成的大鼠胰腺型弹性蛋白酶型的单链DN*段序列为：tta-gtgccataacactcgaaaccgaggtgagacccga-att，序列为721754（不包含3和5末端的-A-T-T序列）2。在ISH前用254nm紫外线照射，能量为10kJ/m2。2.2组织标本准备在ISH中，组织

6、标本的制作非常关键。用清洁磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）配制的4%多聚甲醛对Wistar大鼠进行灌流固定过夜后，用PBS和含有30%(w/v)蔗糖和0.02%(v/v)DEPC的PBS冲洗并保存于4，组织取材后包埋于OCT中以制作冰冻切片。也可采用清洁酒精系列脱水后包埋于石蜡中以制作石蜡切片。大鼠胰腺组织作为阴性对照。2.3原位杂交操作2.3.1切出56m厚冰冻切片至于有涂层的清洁玻片上，迅速风干后置于4045烘箱中2h（如果使用石蜡切片则采用脱蜡程序）。2.3.2用PBS洗3次，每次5min；2.3.30.2mol/LHCl处理20min后用去离子水和PBS清洗；2.3.4用蛋白酶K（pr

7、oteinaseK，1g/ml)在37C条件下处理10min，再用PBS洗净；2.3.5用4%多聚甲醛再次固定5min，再用含有2mg/ml甘氨酸（glycine）的PBS溶液洗两次，每次15min，PBS洗净；2.3.6将标本放入40%去离子化的甲酰胺（formamide）/4xSSC溶液中直到用于杂交；2.3.7在标本上滴下2030l的杂交反应液并保持在湿盒中1517h，温度为37。杂交反应液组成为：10mmol/LTris/HClbuffer(pH7.3),0.6mol/LNaCl,1mMEDTA,1xDenhardtssolution,250g/mlyeasttRNA,125g/mls

8、almonspermDNA,10%dextransulfate,40%deionizedformamide,15g/mlT-T-dimerizedDNAprobe。杂交反应液中不加入DNA探针则作为阴性对照。2.3.8反应结束后用50%formamide/2xSSC洗5次，每次15min。2.4免疫组化操作采用鼠抗T-TIgG单克隆抗体作为一抗，HRP标记的二抗进行反应，通过标准的免疫组织化学方法，用DAB显色，用苏木素进行核染即完成（见图1）。过程中去掉使用鼠抗T-TIgG单克隆抗体的反应步骤同时也作为阴性对照。图1大鼠胰腺型弹性蛋白酶mRNA在胰腺组织中的表达（苏木素核染，X550）Fig

9、.1ExpressionofratpancreaticelastasemRNAinratpancreas3结果与讨论大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色，呈棕色，而细胞核以及内分泌部的细胞均显示阴性，除此外，其他部分的组织细胞同样显示阴性。实验中两种阴性对照的结果均显示阴性。研究结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性的表达胰腺型弹性蛋白酶mRNA，而其他组织细胞不表达。这种运用T-Tdimer特点进行原位杂交的方法具有很多优点。根据需要检测的mRNA的序列，可以任意合成相应的单链DNA探针，操作简便，适用范围广泛，不具有放射性，安全可靠，但在合成探针时应避免选择其中含有相邻T-T碱基的序

10、列。合成的探针序列长度可以比较短，可以避免对探针进行标记的繁杂操作，因而合成的探针分子量较小，非常容易渗透进细胞中，灵敏度极高，特异性强。杂交完成后完全采用常规的免疫组织化学方法显色。在进行免疫染色前，可以在硝化纤维素膜（nitrocellulosefilter）上进行点反应以确定使用抗体的合适浓度。抗T-T的抗体可进行不同的标记，灵活的选用两步或三步法进行，操作方便，并且可以根据需要进行多重染色（包括荧光染色），以及使免疫染色和原位杂交在同一张切片上同时进行，提供细胞蛋白质和mRNA表达情况的多重信息，进一步还可以运用这种方法进行Northern-blot等操作，或根据反应情况对目标基因片段进行定量检测。【参考文献】1KojiT，NakanePKLocalizationinSituofSpecificmRNAUsingThymine-ThymineDimerizedDNAProbes.SensitiveandReliableNon-radioactiveinSituHybridizationJActaPathologicaJaponica,199