酶联免疫吸附法检测庚型肝炎病毒抗体

1、    酶联免疫吸附法检测庚型肝炎病毒抗体        【摘要】目的探讨抗庚型肝炎病毒(HGV)IgG与各种病毒感染、丙氨酸转氨酶(ALT)及HGV RNA的相关性。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测了315例各种肝炎病毒(AE)感染者和117例健康献血员血清的抗-HGV IgG，并测定其ALT，对抗-HGV IgG阳性的标本用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HGV RNA。结果献血员抗-HGV IgG的阳性率为3.42%(4/117)，非AE、HAV、H

2、BV、HCV、HEV、HBV和HCV、HBV和HDV、HBV和HEV病毒感染者抗-HGV IgG阳性率分别为5.95%(5/84)，0(0/3)，3.75%(3/80)，17.28%(14/81)，0(0/15)，33.33%(5/15)，3.33%(1/30)，16.66%(1/6)；抗-HGV IgG和HGV RNA的相关性为30.30%(10/33)，抗-HGV IgG阳性标本中ALT升高率为33.33%(11/33)。结论HGV可以单独或/和HBV、HCV合并感染机体且与HCV密切相关，HGV和HCV合并感染将增加肝脏的损伤程度。【主题词】抗体，病毒；IgG；RNA，病毒；丙氨酸转氨酶

3、；酶联免疫吸附测定；肝炎病毒，庚型 Detection of IgG antibody to hepatitis G virus by ELISAZHENG YouweiLIANG Minwen WANG Jingjian（ Guangdong Provincial People's Hospital, Guangzhou 510080, China）【Abstract】ObjectiveTo study the relation of HGV IgG antibody (anti-HGV IgG) to various viral infections, ALT and HGV RN

4、A.MethodsTo detect anti-HGV IgG from 315 persons infected with various viruses hepatitis (AE) and 117 healthy blood donors by ELISA. The detection of ALT of these peoples, and detect HGV RNA of the samples of positive anti-HGV IgG by RT-PCR were also carried out.ResultsThe positive rate of anti-HGV

5、IgG of 117 blood donors was 3.42%(4/117),and that of the people infected by non AE,HAV,HBV,HCV,HEV,HBV and HCV, HBV and HDV, HBV and HEV were 5.95%(5/84),0(0/3),3.75%(3/80),17.28%(14/81),0(0/15),33.33%(5/15),3.33%(1/30),16.66%(1/6), respectively. The relativity of anti HGV IgG and HGV RNA was 30.30%

6、(10/33), and 33.33% of ALT level in the antibody positive samples were elevated.ConclusionHGV may infect people alone, or coinfect with HBV or /and HCV, but is highly relative to HCV, and the coinfection of HGV with HCV may increase the degree of liver damage.【Key words】Antibody, viral;IgG;RNA, vira

7、l;Alanine aminotransferase (ALT);Engyme-linked immunosorbent assay;Hepatitis G virus1995年发现的庚型肝炎病毒(HGV)是黄病毒科病毒的一个新成员，可引起与丙型肝炎相似的病变。目前检测HGV主要是采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。国内近年也生产了以人工合成HGV多肽或基因重组HGV蛋白为固相抗原来检测特异性抗-HGV IgG的ELISA试剂盒，但临床报道很少。我们用ELISA法检测了315例各种肝炎病毒(AE)感染者和117例健康献血员血清的抗-HGV IgG，并检测其ALT，对抗-HGV IgG阳性

8、的标本用RT-PCR法检测HGV RNA，以探讨抗-HGV IgG与各种肝炎病毒感染者、ALT及HGV RNA的相关性。1材料和方法1.1标本来源血清标本来自广东省人民医院门诊和住院病人及献血员，其中315例为AE型肝炎病毒感染者，117例为健康献血员。1.2方法及试剂抗-HAV IgM、HBsAg、抗-HCV IgG、抗-HDV IgM和抗-HEV IgM的检测均采用ELISA法，试剂均由广东省中山生物工程公司生产并提供，严格按试剂说明书操作；ALT的检测用酶速率法测定，试剂由美国BECKMAN公司提供。HGV RNA的检测采用RT-PCR法(引物设计在5非编码区)，由第一军医大学南方医院医

9、学基因技术中心提供试剂并检测；抗-HGV IgG的检测采用ELISA法，试剂(批号为HGV0121，包被抗原分别来源于E区、NS3区和NS4区的三种合成多肽)由香港SINOCLONE有限公司生产，广东省中山生物工程公司提供，操作按试剂说明书进行，其有效时阳性对照的吸光度A值应大于1.0，阴性对照的A值应小于0.1；待测标本的A值大于Cut off值为阳性，小于或等于Cut off值为阴性(Cut off=0.25+阴性对照的A值)。1.3主要仪器美国BIO-RAD Model 3550-UV酶标仪、美国BECKMAN Cx7生化自动分析仪和美国PE-480基因扩增仪。1.4统计学方法采用2检验

10、。2结果432例(315+117)标本抗-HGV IgG阳性33例(7.64%)，其中10例HGV RNA阳性，抗-HGV IgG和HGV RNA两者的相关性为30.30%(10/33)；以ALT>35IU/L为升高，除献血员外，29例抗HGV-IgG阳性标本中ALT升高11例(37.93%)。10组标本的抗-HGV IgG和HGV RNA的检出率均不同(表1)，其中HBV感染者与HBV和HDV合并感染者、HCV感染者与HBV和HCV合并感染者抗-HGV IgG阳性率均没有差异(前者P>0.5,2=0.22；后者P>0.5,2=0.08)。抗-HGV IgG阳性率最高的是HB

11、V和HCV合并感染者(33.33%)，其次为HCV感染者(17.28%)；抗-HGV IgG和HGV RNA相关性最高的是HBV和HEV合并感染者(100%)，其次为HCV感染者(50.00%)。各组抗-HGV IgG和ALT的检测结果见表2。除与HCV合并感染造成该组ALT显著性升高(P<0.005)外，其他各组合并感染造成ALT升高均没有差异(P>0.5)。3讨论体外实验表明，HGV为嗜肝病毒，传播方式以血、血制品及相关途径为主。HGV感染的诊断目前主要运用PCR来检测病毒RNA，并认为引物设计在5非编码区时检测更灵敏1，而RT-PCR和套式PCR灵敏度也不同2。本研究中抗-H

12、GV IgG和HGV RNA的相关性仅为30.30%，提示虽然PCR检测方法很灵敏，但其在疾病检测中真正的灵敏度和专一性未知，PCR检测有可能降低HGV感染的检出率，尤其是那些感染后康复或病毒不活跃复制的患者。ELISA法检测抗-HGV IgG则可克服上述缺点，而且方便、快捷。结果提示，HGV可以单独或/和HBV、HCV合并感染机体而很少单独与HAV或HEV合并感染机体，这可能由于HGV、HBV和HCV有着共同的易感染因素；HBV和HCV合并感染的病人抗-HGV IgG阳性率最高(33.33%)，其次为HCV感染的病人(17.28%)，然而抗-HGV IgG和HGV RNA的相关性最高则为后者

13、；提示HCV感染或合并感染HCV的病人感染HGV概率较高，这与Linner等3认为HGV和HCV密切相关并在慢性HCV感染的病人中普遍存在HGV感染相一致。HBV和HEV合并感染者抗-HGV IgG阳性率高达16.66%，抗-HGV IgG和HGV RNA相关性为100%，但例数太少(6例)并没有太大的统计学意义。HBV感染与HBV和HDV合并感者、HCV感染者与HBV和HCV合并感染者的抗-HGV IgG阳性率均无差异，提示HBV和HDV、HBV和HCV合并感染并不增加HGV感染的概率。表110组标本抗-HGV IgG和HGV RNA的检测结果Tab.1Detection of anti-H

14、GV IgG and HGV RNA in samples.标本Samples例数Case No.抗-HGV IgG数(%)No.anti-HGV IgG(%)HGV RNA数(%)No.HGV RNA(%)献血员Blood donors1174(3.42)0(0)NonA-E845(5.95)1(20.00)HAV30(0)0(0)HBV803(3.75)1(33.33)HCV8114(17.28)7(50.00)HEV150(0)0(0)HBV，HCV155(33.33)1(20.00)HBV，HDV301(3.33)0(0)HBV，HEV61(16.66)1(100)HBV，HCV，HD

15、V，HEV10(0)0(0)     从生物化学变化上看，抗-HGV IgG阳性的病人，只有37.93%ALT活性升高。非AE肝炎病毒感染者由于HGV感染造成ALT升高和不明原因造成ALT升高无差别，HCV合并感染HGV的病人ALT升高的百分率却显著高于单纯HCV感染的病人；提示单独的HGV感染不一定会引起ALT升高，HCV合并HGV感染后会加重肝脏组织的损伤程度。HBV感染者与HBV和HEV合并感染者再合并感染HGV对ALT升高影响也不大。与HBV和HCV合并感染者相比，HBV、HCV和HGV三种病毒合并感染者的ALT升高的比例并不显著增加，这可能是由

16、于多重病毒感染存在病毒干扰作用。尽管目前对HGV单独感染是否引起肝炎尚有争议，但汪兴太等4用HGV感染5只我国猕猴时发现4只均出现ALT升高，证明HGV感染可引起肝炎。HGV单独感染或与其他病毒合并感染机体是否引起肝炎，可能与HGV感染的阶段性和被感染者肝脏的补偿功能有关。表2抗-HGV IgG与ALT的关系Tab.2Relation of ALT and anti-HGV IgG组别Groups抗HGV IgG阳性Positive anti-HGV IgG抗HGV IgG阴性Negative anti-HGV IgGP值*P value*例数CaseALT升高数(%)No. elevated

17、 ALT(%)例数CaseALT升高数(%)No. elevated ALT(%)Non-AE53(60.00)7951(64.56)>0.5HBV31(33.33)7723(29.87)>0.5HCV147(50.00)6714(20.90)<0.005HBV+HCV54(80.00)106(60.00)>0.5HBV+HEV10(0.00)51(20.00)>0.5     *：同组抗-HGV IgG阳性和阴性标本的ALT升高例数的比较*:Comparison of the ALT level elevation rat

18、e between positive and negative anti-HGV IgG samples in the same group 正常献血员和非AE肝炎病毒感染者HGV感染率分别为3.42%和5.95%；急性非甲戊型肝炎病人抗-HGV IgG阳性率为44.44%(12/27)5。因此HGV感染的检测对预防输血后肝炎及诊断不明病因的非AE型肝炎十分重要。虽然ELISA法检测抗-HGV IgG有可能较PCR法检测HGV RNA灵敏度高，而且更方便、快捷，更适合临床特别是献血员筛选的需要；但目前国内市场上流通的ELISA法检测抗-HGV IgG的试剂盒质量参差不一。马达等6对8种国产的抗

19、-HGV IgG试剂盒进行比较发现最少有37.5%(3/8)不合格，可能与这些试剂盒所选用的固相抗原的质量等有关。貌盼勇等7采用固相多肽合成技术选择合成了7条HGV不同区域的多肽即C区(?)的33肽(sp1)、18肽(sp2)、E区的20肽(sp3)、NS3区的18肽(sp4)、NS5a区的22肽(sp5)、NS5b区的25肽(sp6)和28肽(sp7)，并以上述多肽为固相抗原检测非甲-戊肝炎病人和献血员血清中抗-HGV抗体，发现7条多肽的反应性和检出率各不相同，并认为以sp1、sp3、sp4和sp5等4条多肽为固相抗原间接酶联免疫吸附法检测抗-HGV IgG抗体具有较高的特异性和敏感性。本实验用的试剂盒以HGV的E区、NS3区和NS4区三段不同区域的合成多肽为固相抗原，并对阴、阳性对照和Gut off值都严格限制，这样就保证了检测结果的特异性和灵敏度。尽管目前国际上对ELISA法检测抗-HGV IgG还没有标准，但其在临床上的应用势在必行。所以，为了避免误导临床，应对抗-HGV I