傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段

1、傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段         11-04-23 13:23:00     编辑：studa20               作者：蒋鑫萍 程舸 于雷 王韶 刘晓梅 石磊【摘要】  采用高效液相色谱(HPLC)SCX及C4色谱柱从人乳样品的乳清部分分离与纯化出骨桥蛋白(Osteoponti

2、n, OPN)，在一定条件下将其用胰蛋白酶酶解后，利用高分辨傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)，结合微喷雾(Nanospray)技术，并借助Mascot软件数据库，获得了OPN相关多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱结构信息，分析了其裂解机理。研究表明，利用FTICRMS并结合HPLC等化学方法，可以高效、快速地分离与纯化人乳样品中的OPN，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，能够简洁、准确地鉴定相关多肽片段的结构信息，为OPN多肽片段不同翻译后修饰位点的确定与其生物学活性关系的研究提供了理论依据。 【关键词】  傅立叶变换离子回旋共振质谱，人乳，

3、骨桥蛋白，多肽片段1 引 言随着现代生物技术的进步和生命科学的发展，多肽在生物体内的生理功能越来越受到重视，从天然产物中获得具有生物活性多肽类物质的方法也不断发展。骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是一种重要的多功能细胞外基质蛋白1，能在骨组织细胞、巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞上表达2，在介导细胞的趋化、粘附、增殖和迁移，以及骨组织的矿化与重建、免疫调节、信号传导等方面起着重要作用3,4。OPN是一种含精氨酸甘氨酸天冬氨酸(ArgGlyAsp, RGD)带负电荷的分泌型糖基化磷蛋白，其中包含16个氨基酸的信号肽，剪切后形成298个氨基酸的成熟蛋白，理论分子量约为33 kDa。但由于高

4、度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以达到75 kDa5,6。OPN含有多个与整合素结合的功能域，磷酸化后的OPN主要是以RGD结构与细胞表面的整合素受体(1，3)结合，SVVYGLR多肽位点可以结合41，47和91，而未磷酸化的OPN则不依赖于RGD结构与某些CD44的变异体结合，OPN和细胞表面受体相互作用能诱导信号传导，从而促进细胞的粘附和迁移710。在类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)的病灶中会出现OPN的过度表达，它可能通过调节病灶部位细胞因子的分泌来调控RA病理过程中的炎症反应11,12，并且由于病因不同以及与药物的作用将导致OPN细微结构的复杂化，即会出

5、现不同位点磷酸化或糖基化修饰的OPN多肽片段。因此，从OPN中典型的多肽片段入手，寻找RA中促炎症作用调控网络起关键作用的炎症因子靶点，对于深入认识RA的发病机理和研发新的RA药物具有重要的指导作用。傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)以高分辨率、高质量检测上限、高扫描速度、宽的动态范围和高质量准确度等技术优势1315，越来越广泛地应用到生命科学，特别是在生物大分子的研究中。同时，以基质辅助激光解吸离子化技术和电喷雾离子化技术为代表的新型离子化方法也给FTICRMS拓展了更广泛的应用空间。迄今为止，蛋白质组学研究策略主要包括 “Bottom Up” 和 “Top Down” 两种方法。

6、“Top Down” 是在蛋白质水平上鉴定和研究蛋白质，将完整的蛋白质分子离子有效地解离以获得蛋白质翻译和翻译后修饰及蛋白质非共价键复合物等结构信息16。而 “Bottom Up” 是在多肽水平上鉴定和研究蛋白质，对蛋白质纯度要求不需象二维电泳纯化的蛋白那么高，即可将蛋白质酶解成多肽后再进行分析，覆盖率可达100%，不仅增强了鉴定的可信度，也能更好地鉴定蛋白质翻译后的修饰位点17,18。本研究采用 “Bottom Up” 并结合HPLC和配有Nanospray技术的高分辨FTICRMS等化学方法，快速分离并纯化了人乳中的OPN，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，准确鉴定了OPN中有代表性

7、的多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱裂解机理。2 实验部分2.1 仪器与试剂7.0 T傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICRMS，Thermo公司); 超高速离心机(美国Alfa Wassermann公司);高压液相色谱(美国Waters公司); SCX和C4色谱柱(Sigma公司)。尿素、DDT、TFA、碘化乙酰胺、胰蛋白酶、柠檬酸、柠檬酸铵和乙腈均购自Sigma公司;其它试剂均为国产分析纯。2.2 骨桥蛋白的分离与纯化将人乳样品从-20 冰箱中取出，室温放置2 h后，量取若干样品于Eppendorf管中，以14000 r/min离心45 min，温度控制在不超过0

8、 。离心处理后，参看分离与纯化人乳的流程(图1)，将人乳样品进行初步的分离，得到乳脂部分、乳清部分和乳粒部分。OPN在中层的乳清部分中，除去酪蛋白后的乳清蛋白，采用高效液相色谱配有SCX柱进行初步分离得到8个组分。首先将跟踪、鉴定出OPN的SCX5和SCX6组分合并，然后继续用C4色谱柱进行HPLC分离，最终纯化出乳清部分的蛋白OPN。2.3 蛋白质样品酶解5 g OPN样品与90 L 0.1 mol/L NH4HCO3, 20 L 6 mol/L尿素、4 L 100 mmol/L DDT在56 共同孵育1 h，冷却至室温使其变性与降解。加入4 L 500 mmol/L碘化乙酰胺于室温孵育30

9、 min进行烷化反应。加入100 L 0.1 mol/L NH4HCO3并同时加入胰蛋白酶，于37 孵育16 h消化降解。加入4 L 100%乙酸和81 L 0.1%乙酸，进行淬火反应使反应终止，蛋白OPN即被酶解为多肽片段。2.4 色谱与质谱条件2.4.1 SCX色谱柱色谱条件 流动相A 为20 mmol/L柠檬酸柠檬酸铵(pH 3.0) ， 流动相B 为20 mmol/L柠檬酸柠檬酸铵0.5 mol/L NaCl，(pH 3.0)。 梯度洗脱：020 min, 100% A; 2030 min, 100%90% A; 3040 min, 40%0 A。在洗脱的过程中保持总流速为1 mL/m

10、in。UV检测器，最大波长为280 nm，柱温为35 。2.4.2 C4色谱柱色谱条件 流动相A为 0.1%(V/V) TFA的水溶液，流动相B为 0.1%(V/V) TFA9.9% 水90%乙腈。梯度洗脱：010 min, 100% A; 1020 min, 80%60% A; 2045 min, 60%40% A，4555 min, 40%0 A。在洗脱的过程中保持总流速为1 mL/min，UV检测器，最大吸收波长为280 nm，柱温为40 。2.4.3 质谱条件 多肽溶解于V(水)V(甲醇)V(乙酸)=49492混合溶液中，将样品置于96孔板自动进样系统中，利用配有Nanospray技术

11、(长15 cm的Proxeon nanoESI 发射器，填充物为直径3 m的C18 树脂)的FTICRMS，测定样品的质谱图。流动相A为0.5%乙酸99.5% 水，B为90%乙腈9.5%水0.5%乙酸，流速为500 nL/min，梯度洗脱。FTICRMS金属毛细管电压：2500 V 毛细管温度：110 ; 锥孔电压：-30 V， 碰撞激发电压：2.73.2 V; 碰撞气体为高纯氮气，脉冲时间： 250 ms。3 结果与讨论3.1 骨桥蛋白的分离3.1.1 人乳样品的分离 人乳样品收集自哺乳期为8个月的健康者，样品从-20 冰箱中取出，室温放置2 h后，量取适量样品于Eppendorf管中，以1

12、4000 r/min离心45 min，温度控制在不超过0 。离心处理后，参看分离与纯化人乳的流程(图解1)，将人乳样品进行初步的分离，得到乳脂部分、乳清部分、乳粒部分。OPN在中层的乳清部分中，除去酪蛋白后的乳清蛋白后，采用高效液相色谱配有SCX柱进行初步分离得到8个组分。图解1 分离与纯化人乳的流程Scheme 1 Separation and purification scheme of human milk3.1.2 乳清部分的纯化 首先将跟踪、鉴定出OPN的SCX5和SCX6组分合并，然后继续用C4色谱柱对SCX5和SCX6组分进行纯化，最终得到乳清部分的蛋白OPN。具体实验结果参看人

13、乳乳清部分的纯化流程(图解2)，得到纯度较高的骨桥蛋白OPN。3.2 骨桥蛋白中多肽片段的鉴定 将纯化后样品OPN利用胰蛋白酶在温和条件下进行酶解，利用FTICRMS串联质谱(MS/MS或MSn)，母离子的活化采取碰撞激发解离(CAD)和电子捕获诱导解离(ECD)的方式，根据多肽碎片命名规则以及CAD的CN肽键断裂和ECD的NC断裂在裂解机理上的互补性规律(图解3)，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，分别鉴定了OPN蛋白中有代表性的双电荷分子离子峰为m/z 483.2570的多肽片段和双电荷分子离子峰为m/z 655.3816的多肽片段。在双电荷分子离子峰为483.2570多肽片段的CAD谱图(图1a)中，主要得到b与y离子的信息，b+4：m/z 359.1561，b+5：m/z 458.2245，b+6：m/z 621.2882，b+7：m/z 678.3093，y+2：m/z 288.2031，y+3：m/z 345.2245，y+4：m/z 508.2878，y+5：m/z 607.3561