TGF-β1 诱导肾小管上皮细胞转分化的蛋白质组学研究

1、TGF-1 诱导肾小管上皮细胞转分化的蛋白质组学研究摘摘 要：要：目的: 应用比较蛋白组学方法研究 TGF-1 诱导肾小管上皮细胞转分化（EMT）过程中相关靶蛋白的表达变化。方法: 用双向凝胶电泳（2-DE）对 TGF-1 刺激组和对照组 NRK52E 细胞总蛋白进行分离，两组间差异蛋白点用质谱和数据库搜索鉴定，并在蛋白质和 mRNA 水平上进一步检测验证。结果:鉴定出 22 个差异蛋白，包括与细胞骨架相关蛋白，参与物质转化和能量代谢的酶类，与蛋白翻译后修饰相关蛋白，细胞因子及其它蛋白等。应用 RT-PCR检测了 transgelin，ATP 合成酶 亚型，苹果酸脱氢酶，丝氨酸（半胱胺酸）蛋白

2、酶抑制因子，Ubiquitin-Conjugating Enzyme Ubc9 和表皮生长因子8 在两组间 mRNA 水平存在差异，与 2-DE 结果一致，用 Western blot 验证了transgelin，ATP 合成酶 亚型两种蛋白的表达差异，与 2-DE 结果一致。结论: TGF-1 刺激 EMT 发生过程中可诱导包括与细胞骨架相关蛋白，与翻译后修饰相关蛋白，代谢酶类及细胞因子等多种蛋白表达变化，有助于深入理解EMT 的具体分子机制，阐明肾脏疾病慢性进展的机制。关键词：关键词：蛋白质组学；TGF-1；上皮细胞转分化肾小管间质纤维化在慢性肾脏疾病进展中起重要作用，其主要病理特征是肾间

3、质肌成纤维细胞的增殖活化和细胞外基质的积聚。已有的研究表明，肌成纤维细胞主要来源于肾小管上皮细胞转分化（Epithelial to mesenchymaltransition ，EMT）1，2，3，选择性地阻断肾小管上皮细胞的 EMT 可以明显减轻肾脏纤维化程度4。在致肾脏纤维化的多种细胞因子中，转化生长因子（transforming growth factor，TGF-）被认为是最重要的致纤维化因子。已有的研究证实，TGF-1 致纤维化的主要细胞学现象是诱导肾小管上皮细胞转分化。本研究的主要目的就是利用蛋白质组学方法研究在 TGF-1 介导的转分化细胞模型中究竟导致了哪些蛋白质谱的表达变化以

4、及这些蛋白在肾小管上皮细胞转分化过程中的作用和意义。1.1. 材料与方法材料与方法1.1 主要仪器与试剂NRK52E 细胞(北京协和医院肾内科郑法雷教授惠赠)，胎牛血清和 DMEM-F12 培养基(美国 Gibco BRL 公司)，羊抗 transgelin 多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司），小鼠抗 ATPSynthase 单克隆抗体（美国 BDTransduction laboratories 公司），羊抗小鼠 IgG，兔抗羊 IgG（美国 SantaCruz 公司）TaqDNA 聚合酶(美国 MBI 公司) , Trizol Reagent(美国InvitrogenLife T

5、echnologies 公司) ，DTT、丙烯酰胺、N，N甲叉双丙烯酰胺、尿素、CHAPS、TEMED、胰蛋白酶（美国 Sigma 公司公司），pH310 24cmIPG 预制干胶条、IPG pH 310 缓冲液，IPGphor 等电聚焦系统、Ettan DALTsix 电泳系统 、Image Master 2D platinum 5.0 图像分析软件、Ettan SpotHandling Workstation 工作站，MALDITOF 质谱仪，（瑞典Amershamphamacia biotech 公司），Beckman L765 低温高速离心机（美国Beckman 公司）。1.2 细胞处

6、理NRK52E 细胞培养于含 10%FBS 的 DMEM-F12 培养液中, 置于含 5%CO2 培养箱 37培养。 待细胞生长至 90%亚融合状态时消化，等份分成实验组和对照组两组各三皿，当培养接近 60面积，更换无血清培养基使细胞生长同步化 24小时，实验组加入 10ng/ml TGF1，对照组为等体积无血清培养基，共培养48 小时。1.3 蛋白质提取冰上每皿各加入 250ul 裂解液静置 10 分钟，刮下细胞，超声破碎、20000g 离心 30min 收集上清液，经 Clean up kit 试剂盒纯化细胞总蛋白，去除盐类、脂类等杂质。BCA 法测蛋白浓度。每个样品取 600ug 上样进

7、行双向电泳。1.4 双向凝胶电泳（1）第一向等电聚焦电泳：主要参考 G?rg 等的方法5和 IPGphorTM 等电聚焦系统操作指南进行。（2）平衡：等电聚焦结束后，迅速取出 IPG 胶条于 10ml 平衡液（50mmol/LTrisHcl pH 8.8，6mol/L 尿素，30甘油，2SDS ，1DTT 和痕量溴酚蓝）中平衡 15 分钟，再置于 10ml 平衡液（2.5碘乙酰胺取代 1DTT）中平衡 15 分钟。（3）第二向垂直 SDSPAGE电泳：将平衡后的 IPG 胶条移至 12.5SDSPAGE 连续胶上端，1琼脂糖封固。20循环水恒温，先以 15mA/每块胶进样，再以 30mA/每块

8、胶恒流电泳直至溴酚蓝到达距胶底边 0.51cm 处停止电泳。凝胶固定后以胶体考马斯亮蓝染色。1.5 凝胶图像分析图像扫描仪经调整参数后透射扫描 2DE 凝胶，存储为 tif 文件。以Image Master 2Dplatinum5.0 软件包进行图像分析，产生差异表达蛋白点数据信息。1.6 胶内酶解和质谱鉴定在 Workstation 工作站内利用机械手从胶上挖取差异蛋白点，脱色、脱水，酶解，加多肽提取液孵育，获得的多肽混合液真空蒸发干燥，加基质混匀点样于 MALDI 加样板上，进入 MALDITOF 质谱仪进行肽质量指纹谱鉴定，并在 NCBInr 数据库中行蛋白查询。1.7 半定量逆转录聚合

9、酶链反应（RT-PCR）及蛋白质免疫印记（Westernblot）验证结果蛋白质免疫印迹检测 transgelin，ATP 合成酶 亚型 2 种蛋白质在刺激组与空白对照组中的表达丰度差异，化学发光分析系统进行灰度分析，计算待测指标与内参 GAPDH 灰度的比值。半定量逆转录聚合酶链反应检测transgelin，ATP 合成酶 亚型，表皮生长因子 8，丝氨酸（半胱胺酸）蛋白酶抑制因子，Ubc9 和苹果酸脱氢酶 6 种蛋白 mRNA 水平的表达差异，计算待测指标与内参 GAPDH 吸光度 A 的比值。2.2. 结果结果2.1 双向凝胶电泳分析我们选择 pH 310 范围的非线性干胶条进行第一向等电

10、聚焦电泳。第二向电泳为 12.5SDS-PAGE。TGF1 刺激组和对照组分别重复 3 次， 共获得6 块 2D 胶图谱。从所获得的结果来看，所有的蛋白表达谱均类似，多集中分布于 pI 48 间的区域（见图 1），以 ImageMaster 2D platinum 5.0 软件包将凝胶分成 2 个类别进行点的图像分析。选择其中 2DE 效果好、点数多的一块胶作为参考胶，进行两组间的匹配分析，筛选出每组三块胶中均存在的 2 倍及以上的差异点有 39 个。2.2 差异蛋白点质谱鉴定挖取所有 39 个蛋白点，然后用胰蛋白酶胶内酶切，在 MALDITOF 质谱仪上得到特征性的多肽质量谱并最终鉴定出 2

11、2 个蛋白点，其中上调表达 17 种，下调表达 3 种，新生蛋白 2 种。在相同细胞培养及 TGF-1 刺激条件下，利用半定量逆转录聚合酶链反应验证 transgelin，ATP 合成酶 亚型，表皮生长因子 8，丝氨酸（半胱胺酸）蛋白酶抑制因子，Ubiquitin-Conjugating Enzyme Ubc9 和苹果酸脱氢酶 mRNA水平的表达差异，结果与蛋白组学所得结果一致，TGF-1 刺激 NRK52E 细胞可明显上调这 6 种蛋白 mRNA 表达水平（P0.05）。同时用蛋白质免疫印记验证 transgelin 和 ATP 合成酶 亚型在刺激组与对照组中的表达差异，结果与蛋白组学所得结

12、果一致，这两种蛋白在刺激组表达水平均上调（P0.05）。3.3. 讨论讨论肾小管间质纤维化是所有慢性肾脏疾病向终末期肾病发展的共同路径，也是决定肾脏疾病进展速率的主要因素。肾小管间质纤维化的组织学特征是肾小管萎缩和细胞外基质的积聚，细胞外基质被认为主要是由平滑肌肌动蛋白（-SMA）阳性肌成纤维细胞产生。已有的研究表明，TGF-1 是具有多种重要生物学作用的生长因子，在多种器官和组织的纤维化过程中发挥重要作用，包括肾小管间质纤维化的发生发展过程。近年研究表明，TGF-1 诱导的肾小管上皮细胞转分化是导致进展性肾小管间质纤维化的重要环节。因此，研究 TGF-1 诱导 EMT 发生过程中靶蛋白的表达

13、变化有助于更全面认识 TGF-1 的作用机制，并据此探讨针对靶蛋白的特异性防治肾脏纤维化的措施。我们利用蛋白质组学技术观察 TGF-1 刺激肾小管上皮细胞发生 EMT 后的蛋白表达谱，并与空白对照组比较，结果鉴定出 22 种差异表达蛋白，其中上调表达 17 种，下调表达 3 种，新生蛋白 2 种，多数是参与物质转化和能量代谢的酶类，另外还包括与细胞骨架相关蛋白，与蛋白翻译后修饰相关蛋白，细胞因子及其它尚未有明确功能研究报道的蛋白。本研究检测出一组细胞骨架相关蛋白均上调表达：transgelin、膜联蛋白A8、ERM 结合磷蛋白、destrin、肌动蛋白相关蛋白 2/3 复合体以及微管相关蛋白。

14、transgelin 最先发现于平滑肌细胞，由 Tagln 基因编码，是一种对细胞转化和形态变化敏感的肌动蛋白交联蛋白。最近研究显示，transgelin 表达下调可通过减少肌动蛋白数量，影响肌丝结构而使小鼠血管平滑肌伸缩力下降8。transgelin 在 TGF-1 刺激组中表达上调，可能与上皮细胞转分化过程中肌丝重组导致细胞伸缩力的增强相关，可引起细胞迁移力，侵袭力增强。肌动蛋白相关蛋白 2/3 复合体由 7 个亚单位组成，在细胞内受到多种核化促进因子的调节，并与这些因子协同作用来调节肌动蛋白的核化，介导了新微丝的产生，并将这些新微丝连接成为高度有序的网状结构9。在 TGF-1 刺激组肌动

15、蛋白相关蛋白 2/3 复合体上调表达可能加速肌动蛋白装配成微丝，对细胞骨架和细胞形态的改变发挥重要作用。细胞骨架是真核细胞中蛋白纤维网状骨架体系，其功能不仅在于维持细胞形态，保持细胞内部结构的有序性，参与细胞运动，而且是细胞内信息传递的传导装置，影响细胞基因表达的整体调控。NRK52E 细胞在转分化过程中，细胞极性消失，细胞形态由卵圆铺路石样变为细长纤维状，这与细胞骨架的变化是密不可分的，因此这些细胞骨架相关蛋白的上调表达可能促使细胞骨架蛋白如微管、微丝等的重组，在细胞内形成张力丝，使细胞黏附力下降等。肾小管 EMT 的发生主要涉及上皮细胞黏附特性丧失，肾小管基底膜的破坏以及细胞迁移力，侵袭力

16、的增强，这些都与细胞骨架的改变相关。本研究鉴定出两种与蛋白翻译后修饰相关的蛋白，Ubc9 和泛醇 1。Ubc9是蛋白 SUMO 化过程中唯一的 SUMO 结合酶，SUMO(small ubiquitin-relatedmodifier)是泛素(ubiquitin)类蛋白家族的重要成员之一，SUMO 化（sumoylation）与泛素化（ubiquitination）不同，它并不促使蛋白质降解，反而是加强蛋白质的稳定性或是调节蛋白在细胞内的定位和分布，调节蛋白之间的相互作用以及影响蛋白质的转录活性10，11。新近的研究显示 SUMO 化可能参与调节 Smad 家族蛋白的功能。同时共表达 Ubc9

17、 或 SUMO-1 能显着增强Smad4 的 SUMO 化，还可促进 Smad1，-2，-3 与 SUMO-1 的结合，但明显弱于Smad4 的 SUMO 化水平12，13。TGF-1 刺激能增强 Smad4 的 SUMO 化，抑制 Ubc9 的表达可抑制 Smad4 SUMO 化水平的增高，还显着降低 TGF-1 所介导的 PAI-1 的产生14。我们发现 TGF-1 刺激能导致 Ubc9 上调表达，这可能是 TGF-1 刺激下 Smad4 的 SUMO 化水平增高的重要环节。Smad 家族蛋白是介导 TGF-1 作用的重要信号通路，TGF-1 刺激上调表达 Ubc9，促进SUMO 化反应，

18、进而保持其下游关键信号蛋白 Smad 的稳定性，从而帮助实现TGF-1 的生物学效应。在 TGF-1 诱导肾小管上皮转分化的细胞模型与对照组细胞蛋白质组的比较分析中，我们获得了许多差异蛋白质信息，也遇到一些值得探讨的新问题，这些蛋白质信息将为我们全面搜寻与 TGF-1 促使细胞转分化相关的蛋白提供有价值的参考资料，而面临的新问题将促使我们从新的角度探讨 TGF-1 诱导细胞转分化的具体机制。十年论文机构京都名师论文中心，正规全面的论文刊物为您提供职称论文，毕业论文，硕士论文，医学论文，教育论文等各类论文发表服务。参考文献参考文献1. Yang J,Liu Y: Dissection of ke

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