制备淋巴瘤多基因肿瘤疫苗的方法学探索

1、制备淋巴瘤多基因肿瘤疫苗的方法学探索【摘要】 目的探讨用于淋巴瘤的多基因肿瘤疫苗的制作方式及淋巴瘤的基因治疗方法。方法采用腺病毒转染、脂质体辅助转染、脂质体辅助腺病毒转染的方式，将带GFP的载体转染B系淋巴瘤A20细胞株，并以Hela细胞作为对照，荧光显微镜下观察转染效率。将B7-1与CIMOL表达载体联合导入A20荷瘤小鼠肿瘤内，观察肿瘤生长情况，应用肿瘤病理切片和HE染色技术观察肿瘤组织形态及淋巴细胞浸润情况。结果对A20细胞而言，单纯脂质体和单纯腺病毒转染效率均非常低，脂质体辅助腺病毒转染效率有所提高。但均显著低于采用腺病毒转染Hela细胞。瘤内联合注射B7-1和CD40L表达载体可导致

2、肿瘤生长延缓及体积缩小，肿瘤消退效应较明显。肿瘤形态学观察表明，治疗小鼠肿瘤局部有炎性细胞浸润并伴有大面积的坏死，肿瘤局限化。结论B系淋巴瘤细胞株难于通过体外基因导入制作肿瘤疫苗，脂质体辅助腺病毒转染效果较好，质粒载体瘤内注射可作为一种安全有效的肿瘤疫苗作用方式。【关键词】淋巴瘤；肿瘤疫苗；基因治疗；腺病毒；脂质体；B7-1；CD40L随着淋巴瘤发病率的逐年增加，越来越多研究人员对于淋巴瘤的治疗产生了浓厚的兴趣，在传统的三大疗法之外，人们期待采用单克隆抗体、细胞及疫苗为主的免疫治疗作为攻克难治和复发型淋巴瘤的有效武器。采用基因修饰的淋巴瘤细胞疫苗来调控免疫系统是极具价值的治疗淋巴瘤的方法，但是

3、肿瘤的发生发展是多因素、多阶段与多基因作用的结果，单一免疫基因导入的抗肿瘤作用是十分有限的，越来越多的疫苗开始采用基因联合的方法。B7-CD28与CIMO-CIMOL是2条重要的共刺激通路，参与调节T细胞的活化与增生，促进细胞因子的分泌。最近发现CD40可以上调B71的表达，提示两者在肿瘤的免疫治疗中可能存在协同效应。本研究旨在寻找适合于淋巴瘤的多基因疫苗制作方法，尝试寻找安全有效的淋巴瘤基因治疗途径，为将来的临床前期实验提供理论依据。1 材料和方法11 实验材料1)细胞株：淋巴瘤细胞株A20源自BALBc小鼠，由第二军医大学曹雪涛教授惠赠，人宫颈癌Hela细胞株由北京大学医学部毛学斌教授惠赠

4、，均37 cC培养于含10胎牛血清的1640培养基中。2)质粒与腺病毒：带GFP的腺病毒由诺赛基因中心提供，带GFP的质粒由北京大学第三医院整形科实验室聂芳菲提供。P Ecoli菌和mB7-1质粒由美国DanaFarber肿瘤研究所Freeman GJ教授惠赠，转化了mCIMOL质粒的菌株由中南大学湘雅二医院肝病中心蒋永芳教授惠赠。3)动物：30只雄性BALBc小鼠，68周龄，购自北京大学医学部实验动物部。4)主要试剂：RPMI 1640培养液由RPMI 1640粉配制(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；脂质体转染试剂盒lipofection-2000(Invi

5、trogen公司)；Qiagen Plasmid Maxi质粒提取试剂盒(美国Qiagen公司)；Xho I、EcoR I限制性内切酶、BSA(TaKaRa公司)；Nhe I限制性内切酶由北京大学医学部毛学斌教授惠赠。12 实验方法1)单纯脂质体转染取24孔板，调整细胞浓度，410 细胞，500无血清1640重悬； 按以下比例：保持DNA量不变，脂质体量增加，第1孔DNA 08 g，脂质体12L，第2孔DNA 08 Ixg，脂质体2 IxL，第3孔DNA08 Ixg，脂质体32 IxL，第4孔DNA 08 Ixg，脂质体4ixL；保持DNA和脂质体比例不变，DNA量增加，第1孑L DNA 08

6、 Ixg，脂质体2 IxL，第2孑L DNA 16 Ixg，脂质体4 IxL，第3孔DNA 24 Ixg，脂质体6 IxL，第4孔DNA 32xg，脂质体8 L；带GFP的质粒DNA以Opti-MEM重悬，终体积50 L，轻柔混匀；脂质体转染前以Opti-MEM重悬，终体积50 L，室温孵育5 min；将DNA与脂质体的悬液轻柔混匀，室温孵育20min；将此混悬液按顺序加至各孔与细胞混匀；置37 cC温箱，46 h后，加入含20FBS的1640培养液600 L，48 h后观察转染效率。2)单纯腺病毒转染A20细胞转染： 取24孔板，调整细胞浓度，每孔1 x 10 细胞，1 mL 1640培养液

7、重悬；带GFP的腺病毒以灭菌水稀释，分别按MOI：1 000、500、200、100、50、0加到6个孔内，混匀； 置37 cC温箱，72 h后荧光镜下观察转染效率。以Hela细胞为对照：取24孔板，调整细胞浓度，每孔410 细胞，1 mL 1640培养液重悬，置37 cC温箱孵育2 h；带GFP的腺病毒以灭菌水稀释，分别按MOI：1 000、500、200、100、50、0加到6个孔内，混匀；置37 cC温箱，72 h后荧光镜下观察转染效率。3)阳离子脂质体辅助转染调节细胞浓度，110 细胞加入孔板，500无血清1640重悬；带GFP的腺病毒设MOI：1 000、500、200、100、50

8、、0 6个孔；带GFP的腺病毒以50IxL OptiMEM重悬，轻柔混匀；1 IxL脂质体以50 LOptiMEM重悬，室温孵育5 min；将腺病毒与脂质体的悬液轻柔混匀，室温孵育20 rain；将此混悬液按顺序加至各孔与细胞混匀；置37 cC温箱孵育，48h后观察转染效率。4)质粒DNA的扩增与提纯用Qiagen plasmid maxi试剂盒大量提取空载体质粒、B71及CIMOL质粒，酶切鉴定，紫外分光光度计准确定量，溶于无菌PBS，调节浓度为I gL，备用。5)构建荷瘤小鼠模型将对数生长期的210。A20细胞皮下注射于BALBc小鼠右侧背部，构建荷瘤小鼠模型。6)B71与CIMOL表达载

9、体对淋巴瘤的治疗本实验分5组，每组6只BALBc小鼠。小鼠约在79 d成瘤，按如下方式分组：空白对照(每只注射PBS 100 )；空质粒对照(1 gL，每只注射50L pcDM8和50 IxL pcDNA31)；B71质粒单独注射(1 gL，每只注射100 )；CD40L质粒单独注射(1 gL，每只注射100 )；B71+CIMOL质粒联合注射(1 gL，每只注射50 L B71和50 LCD40L)。待小鼠淋巴瘤直径为7 mm时，将每组3只进行质粒注射，观察肿瘤生长情况，并取瘤组织制作病理切片进行形态学观察。7)病理学观察取小鼠肿瘤组织固定包埋，做5 m石蜡切片，HE染色，镜下观察肿瘤组织的

10、形态及肿瘤坏死情况。13 统计方法应用SPSS 100软件进行统计分析，率及两样本间均数的比较用 检验。P005为差异有统计学意义。2 结果21 脂质体单独转染单纯脂质体转染A20细胞，转染效率并不随DNA和脂质体的量及比例的变化有太大不同， 均低于2 染效率为1 3 3 0 5 8 ；M O I 为5 0 0 时转染效半勾6 3 3 1 5 3 ；M ( ) I 为1 0 0 0 时转染效率为1 0 - 4-2 、阳离了脂质体辅助组的转染率叫黟高于单纯腺病毒转染组， 差异有统计学意义( P () 0 5 ) 。2. 2 重组腺病毒对不同细胞株的感染采用腺病毒转染A 2 0 细胞， 当M O

11、I 为10 0 、2 0 0 、5 0 0时4 i 能检测到ll：t件荧光细胞， M O I 为1 0 0 0 叫 转染效率为1 3 3 0 5 8 。住H e la 细胞组， M O I 为10 0 时转染效率为1 2 3 3 2 5 2 ；M O I 为2 0 0 时转染效率为3 4 3 3 - 1- 2 0 8 ；M O I 为5 0 0 时转染效率为5 5 5 ；1( ) I 为l 0 0 0 时转染效率为6 8 3 3 2 8 9 。H e l a 组的转染率明显高于A 2 0 组， P 0 0 5 。23 单纯腺病毒转染与脂质体辅助腺病毒转染单纯腺病毒转染组， 当M O I 为1

12、0 0 ，2 0 0 ， 5 0 0 时小能检N Y- lJ Ij口性荧光细胞， M O I 为l 0 0 0 时转染效率为1 3 3 ek 0 5 8 。： 在阳离子脂质体辅助组， M O I 为1 0 0 时转染效率为1 3 3 0 5 8 ；M O I 为2 0 0 时。24 B 7 - 1 与C D 4 0 L 表达载体对淋巴瘤的治疗联合B 7 1 和C D 4 0 L 基因治疗盲径大丁7 l l l l l l 的肿瘤， 1 3 d 内肿瘤肚本消退， 肿瘤直径为3 I l l Il l 以卜单独基因治疗绀月中瘤生长得到抑制，P B S 与质粒i II H巾瘤生长迅速， 在1 3 d

13、时肿瘤直径达到17 2 0 13 1 11 1 统汁学俭验显爪， 自注射后第5 大起， P B S 、质粒组与联合治疗组的瘤体体积的差异开始有统计学意义( 尸0 0 5 ) 。注射后第6 天起， 联合治疗组的瘤体体积j单独治疗组的差异开始有统计学意义( P 0 0 5 ) i单独治疗组与P B S 、质粒组的瘤仆体积筹异并不总有统计学意义 。肿瘤注射后第1 9 天直径达到7 m n I 左右， 在第19灭和第2 6 天分别给予2 次注射。25 病理形态的结果结果显示， 治疗组肿瘤组织坏死严重， 炎性细胞浸润增加( 图5 ) 、病理切片显示， B 7 1 与C 1)4 0 1 译基因治疗组的肿瘤

14、病灶周围有少量炎性细胞浸润， 可弛散在坏死灶；联合治疗纽肿瘤病灶内有大量炎性细胞浸润， 并伴有大片坏死， 肿瘤细胞散住，肿瘤局限化。3 讨论随着人们对恶性肿瘤病因病理学的深入了解，得知肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段与多基因作用的结果，因此在肿瘤临床治疗中越来越多地采用多种疗法相结合的方式。近年来，人们逐渐把目光投向了生物疗法，尤其是基于肿瘤逃逸机制的免疫疗法。肿瘤疫苗目前已经取得了令人鼓舞的成果。其中以体外导入抗原基因制作的肿瘤基因工程疫苗的研究最为广泛和深入，许多已经进入临床I期 。肿瘤基因工程疫苗制作的关键是如何将目的基因导入靶细胞内，并使其有效表达，从而发挥抗肿瘤作用。目前用于基因转

15、移的有物理方法，化学方法和生物方法。物理和化学方法转染效率低但相对安全，病毒转染效率高但有潜在危险性。北京大学第三医院血液科实验室前期采用电穿孔和脂质体转染的方式，将外源性基因导入血液系肿瘤，转染效率并不理想。有报道 称，脂质体辅助腺病毒可以提高悬浮细胞的转染效率。因此本实验采用B系淋巴瘤A20细胞株对几种转染方法的转染效率进行了探讨。本研究采用腺病毒转染、脂质体转染和脂质体辅助腺病毒转染的方式转染B系淋巴瘤A20细胞株发现，前两者转染效率低，明显小于脂质体辅助腺病毒组(P005)。单纯脂质体辅助转染随着DNA与脂质体量的增加和比例的变化，其转染效率并无明显增加。单纯腺病毒转染A20细胞系在M

16、OI为500时也未检测到荧光阳性细胞，仅在MOI为1 000时有133 058的荧光表达，远低于腺病毒转染Hela细胞的转染率6833 289(P005)。对于腺病毒和腺相关病毒而言，要进入细胞，需先和细胞表面的受体结合，继而在仅 整合素介导下被细胞内吞。淋巴细胞表面缺乏受体和整合素，因此很难被转染。有研究机构成功采用腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒将外源性基因导入B系淋巴瘤细胞 。但国内外对于血液系肿瘤，尤其是不同来源的细胞系的转染敏感性报道不一 J。脂质体辅助腺病毒转染A20细胞系在MOI为1 000时转染效率可达到10 2，说明脂质体可在一定程度上提高腺病毒的转染效率。这可能是腺病毒可以通

17、过电荷作用与阳离子脂质体形成复合物，复合物表面被阳离子包裹，与带负电荷的细胞表面相互接触，细胞内吞或通过胞膜融合摄取腺病毒与脂质体的复合物。由于这种摄取方式可以不依赖柯萨奇病毒和腺病毒联合受体(CAR)、整合素的参与，所以提高了转染效率。但仍低于无脂质体辅助的对Hela细胞的转染率(P005)。本实验未考虑使用逆转录病毒，一方面是因为其携带的基因不能太大，对于多基因共同表达的较大载体，如本实验需构建的双基因载体约10 000，超出逆转录病毒的负载；另一方面，逆转录病毒用于人体缺乏安全性。本研究采用体外导入抗原基因制作的肿瘤基因工程疫苗的方式在B 系淋巴瘤中并未取得令人满意的效果。近年来直接瘤内

18、注射的肿瘤基因疫苗日益受到人们的关注。非病毒载体特别是质粒载体， 由于其相对病毒载体更为安全且简便， 使得用它来携带目的基因制作疫苗的研究逐渐增多。携带共刺激因子的质粒载体注入瘤内可被肿瘤细胞所摄取， 表达于肿瘤细胞表面， 参与呈递第二信号， 增强肿瘤细胞的免疫原性。多项研究结果也汪明了直接瘤内注射在不同肿瘤中取得的抗肿瘤效应。叭 。本实验将提纯的ro B 7 一l 与m C D4 0 L 联合注入荷瘤小鼠肿瘤内， 肿瘤在1 3 d 内基本消退， 而对照组和空载体组肿瘤生长迅速， 差异有统计学意义。病理切片发现， 对照组、空载体组以及B 7 1 与C D 4 0 L 单基因治疗组可见到大量的肿瘤细胞， 病灶周围有少量炎性细胞浸润， 有坏死灶；而在联合治疗组肿瘤病灶内大量炎性细胞浸润， 并伴有大片坏死， 肿瘤细胞散在分布， 肿瘤局限化。B 7 1和