BSA毛细管电色谱柱的制备及对映体分离

1、BSA毛细管电色谱柱的制备及对映体分离伍品端 马志玲*（中山大学化学与化学工程学院，广州，510275）论文摘要 整体柱是近年发展起来的一种新型的色谱分离分析技术。本组实验以甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯为单体和交联剂，以环己醇和正十二醇溶剂和致孔剂，在毛细管内聚合制得整体柱。对整体柱基质用BSA进行修饰，制成手性整体柱后，1用于组氨酸对映体进行手性分离，并考察了缓冲液pH值对保留时间和分离度的影响。关键词 整体柱；手性分离；毛细管电色谱；牛血清白蛋白一 前言手性药物各对映体的药效学等方面可能存在很大的差异。所以对映体拆分方法具有十分重要的意义。目前主要利用色谱技术实现对各对映体的

2、拆分，例如气相色谱、高效液相色谱、薄层色谱、超临界流体色谱和毛细管电泳等。2毛细管电色谱（CEC）是一种新的微柱分离技术，结合了毛细管区带电泳的高柱效和高效液相色谱高选择性的优点，具有高效、快速、微量等诸多特点，已成为近年来色谱领域研究的热点之一。3目前使用的毛细管电色谱柱主要有三类：填充毛细管电色谱（PCCEC）；开管毛细管电色谱（OTCEC）；整体柱（monolithic column）毛细管电色谱。PCCEC制备较困难，并存在焦耳热效应、塞子效应和气泡效应。OTCEC的柱容量和相比较低。4毛细管电色谱整体柱具有制柱过程简单，柱容量大，渗透性好，可在高流速下操作而不影响其分辨率，在分离过程

3、也不易产生气泡,是目前发展最为迅速的CEC柱技术。 5 整体柱分为聚合物整体柱和硅胶整体柱两类。6硅胶整体柱在多孔内壁引入功能团进行改性较困难，在干燥和热处理过程中柱床极易收缩和断裂。聚合物型整体柱具有制备简单、容易控制孔径、重现性好、柱效高及分离快等优点，且稳定性高，能承受较苛刻的流动相条件、pH范围、缓冲液盐浓度以及后继改性剂的种类等都不会对聚合物整体柱固定相的稳定性造成负面影响6。本组以甲基丙烯酸甘油酯（GMA）为单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）为交联剂， 环己醇（CyOH）为溶剂，正十二醇（DoOH）为致孔剂，以偶氮二异丁腈（AIBN）为催化剂，在毛细管内聚合制得了整体柱。由于在

4、聚合混合物含有交联剂和致孔剂时，整体柱中的大孔结构的形成是在聚合过程中的相分离时发生的。所以孔性质的控制方法有选择致孔剂、调节致孔剂和交联剂的用量以及控制反应温度等，以此来控制聚合过程中相分离的速率，进而控制孔的大小等性质。78手性引入的方法有柱前手性衍生化法，该法操作较繁琐。手性流动相添加剂法，其缺点是消耗手性试剂量大，且拆分效果往往不及手性固定相法。手性固定相法，该法不须衍生化，操作简便，也不需要大量昂贵的手性添加剂29本组以牛血清白蛋白（BSA）为手性选择剂，键合到整体柱基质上，形成手性固定相，进而用于拆分对映体。二 实验部分（一）主要试剂甲基丙烯酸缩水甘油酯（纯度97.0%，德国Flu

5、ka化学试剂公司）； 二甲基丙烯酸乙二醇酯（纯度97.0%，德国Fluka化学试剂公司）; 环己醇（化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司）； 正十二醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）； 偶氮二异丁腈（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；甲醇（分析纯，广州中山大学化学院第六届创新研究基金资助（批准号：200608）第一作者：伍品端，中山大学化学与化学工程学院化学工程与工艺专业（2002级）指导老师：马志玲 副教授，（联系方式：cesmzl）化学试剂厂）；三羟甲基甲胺(Tris，分析纯，FACRO CHEMICAL SUPPLIES);牛血清白蛋白（上海伯奥生物科技有限公司）；D,L-组氨酸（

6、层析纯，中国科学院上海生物化学研究所）；L组氨酸（层析纯，中国第二军医大学政翔化学试剂研究室）。其余试剂为分析纯。（二）毛细管壁预处理依次用1 mol·L-1的NaOH溶液、去离子水、0.1mol·L-1的HCl、去离子水冲洗毛细管内壁30min，再用无水甲醇冲洗10min，最后用N2吹干。（三）毛细管整体柱的制备按比例将GMA和EDMA混合为A溶液，将CyOH和DoOH混合为B溶液，再把A溶液和B溶液按比例混合，加入相当于溶液总质量的1的AIBN。经超声波得到均匀溶液，再向溶液通N2约10min。将溶液注入经预处理的毛细管内，两端密封，用60水浴24h。聚合的反应如图所示

7、。 合成整体柱后，依次用甲醇和蒸馏水以0.001mL·min-1流速冲洗整体柱4h。图 整体柱聚合的反应（四）手性整体柱的制备配制pH 7.4，67mmol·L-1生理磷酸盐缓冲液。称取适量BSA溶于生理磷酸盐缓冲液中，配成4mg·mL-1的BSA溶液。又配制pH 8.0，50mmol·L-1的Tris-HCl缓冲溶液。将以上制得的毛细管柱用生理磷酸盐缓冲液冲洗约1h，再将4mg·mL1的BSA溶液通过毛细管柱24h。再用生理磷酸盐缓冲液冲洗柱子约1h，然后分别用纯净水和pH=8.0的50mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液冲洗2

8、h，最后用磷酸盐缓冲溶液冲洗4h。（五）整体柱的观察 在小试管中合成整体柱后，将小试管打破，取出整体柱并压碎，用甲醇萃取12h。然后烘干1d，准备用氮吸附法和场发射扫描电镜观察整体柱的孔径分布。（六）毛细管电色谱实验1 配制2mmol·2 配制样品溶液·L1的样品溶液。取相同体积50mg·L-1的D,L-组氨酸(用pH5.5缓冲溶液配制)和L-组氨酸溶液(用pH5.5缓冲溶液配制)混合，配成50mg·L-1的D,L组氨酸L-组氨酸溶液。3 电泳实验各种用于CEC的缓冲溶液、样品溶液在使用前经0.45滤膜滤过并超声脱气。在手性毛细管柱的一端施加一定的正电压

9、，使用pH=5.5的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液通过手性毛细管柱，在此期间通过控制电压使电流不超过5uA。约过30min左右使基线平稳。分别重力进样用pH5.5缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L-组氨酸和8s。在6.0kV的分离电压下，以pH=5.5的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液作运行液，采集电导信号20min。重力进样用pH6.0缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L-组氨酸8s。在6.0kV的分离电压下，以pH=6.0的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液作运行液，采集电导信号。重力进样用pH5.0缓冲溶液配制的浓度为50mg

10、·L-1的D,L-组氨酸8s。在6.0kV的分离电压下，以pH=6.0的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液作运行液，采集电导信号。三 结果与讨论（一）整体柱性质的影响因素 1 GMA/EDMA对整体柱性质的影响固定CyOH和DoOH含量为50%和10%（v/v），改变GMA与EDMA的比例，于60下水浴反应24h后，考察合成整体柱的渗透性能，如表所示。表 GMA/EDMA对整体柱渗透性的影响样品号 GMA/EDMA 流速（mL/min） 背压（MPa）C3# 3:2 0.001 0.5C6# 1:1 0.001 0.7C7# 2:3 0.001 5.2交联剂含量越大，在聚合过程

11、中相分离越迟，使得整体柱的孔径越小，在流速一定下，整体柱的背压越大。若交联剂含量太低，聚合物整体柱的硬度会不够；若交联剂含量太高，则使整体柱中的单体GMA含量不够，不利于进一步对整体柱的修饰。根据实验确定采用GMA/EDMA比例为3/2。2 不良溶剂DoOH含量对整体柱性质的影响固定GMA和EDMA含量分别为24%和16%（v/v），（CyOH+DoOH）总含量为60%（v/v），改变DoOH含量，于60下水浴反应24h后，考察合成整体柱的渗透性能，如表所示。不良溶剂DoOH在聚合混合物中的比例增加，使聚合过程中相分离较早发生，核与系统中剩余的单体作用增大，于是，就更容易形成大的单元小滴，转变

12、为较大的孔，整体柱背压较低。表 不良溶剂DoOH含量对整体柱渗透性能的影响样品号 DoOH百分含量（v/v） 流速（mL/min） 背压（MPa）K1# 50 0.005 5.1K1# 40 0.005 8.5K3# 30 0.005 9.5K4# 20 0.005 >9.5K5# 10 0.005 >10.93 单体GMA含量对整体柱中活性基团环氧基含量的影响固定致孔剂DoOH和溶剂CyOH的含量分别为50和10，分别制备GMA含量为24和16的样品C3#和C7#,用红外光谱法考察环氧基含量，如图所示。图中红色是C3#样品的红外光谱图，绿色是C7#样品红外光谱图。单体GMA含有环

13、氧基和酯基。交联剂EDMA含有酯基。由图可见，对于环氧基在908cm-1和850750cm-1区间的两个吸收峰，含有较大比例GMA的C3#样品比含有较小比例GMA的C7#样品在的吸收峰大。可见，单体GMA的比例越大，整体柱的活性基团环氧基含量就越大。另外，酯的c=o由于和双键共轭而使吸收峰向右移动至1729cm-1；在13001000cm-1区间内出现了C-O伸缩振动的两个吸收峰，分别出现在1151cm-1和1259cm-1。对于酯在这两个区间的吸收峰，含有较小比例EDMA（即较大比例GMA）的C3#样品比含有较大比例EDMA的C7#样品的峰面积更小，与事实相符。10图 C3#和C7#样品的红

14、外光谱图（二）整体柱的观测 1 扫描电镜（SEM）固定GMA和EDMA含量，改变DoOH与CyOH比例，按表合成整体柱，用SEM法考察DoOH含量对整体柱孔径的影响。SEM测试结果如图图所示。由各SEM图可以看出，在GMA和EDMA含量固定的前提下， DoOH含量越高，整体柱的孔径就越大。从K1#K5#，致孔剂的含量从50降至10，整体柱的孔径以此约为4856nm、40nm、32nm、1630nm、10nm。2 氮吸附法在液氮温度下，氮分子在材料表面的物理吸附量取决于氮气的相对压力P/P0（P为氮气分压，P0为液氮温度时氮的饱和蒸气压）。当P/P00.4时，由于产生了毛细凝聚现象，吸附量与表面

15、微孔的尺寸相关。以此为基础，成为测定孔径分布的依据。表整体柱原料比例样品号 GMA%(v/v) EDMA%(v/v) CyOH%(v/v) DoOH%(v/v)K1# 24 16 10 50K1# 24 16 20 40K3# 24 16 30 30K4# 24 16 40 20K5# 24 16 50 10 图K1# SEM图 图K2# SEM图 图K3# SEM图 图K4# SEM图 图K5# SEM图 图整体柱孔径分布图本组实验所采用的K1#氮吸附法测定孔径分布结果如图所示。由氮吸附法测得的孔径分布图图可以看出，K1#整体柱孔径范围主要分布在5090nm左右，和SEM测得的结果基本相符。

16、（三）流动相的pH值对手性分离的影响该组实验中，键合在整体柱表面的手性选择剂BSA的等电点pI=4.7，并且在pH=59的范围内稳定。当CEC运行缓冲溶液的pH在BSA的稳定pH范围内时，由于运行缓冲溶液的pH大于BSA的等电点，所以BSA表面就会带负电荷，于是CEC中会产生正向电渗流。并且随着pH值的增大，BSA解离的负电荷会增多，使得正向电渗流增大。用pH5.5的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液作运行缓冲溶液，运行30min左右使基线平稳。重力进样用pH5.5缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L-组氨酸8s，在6.0kV的分离电压下，分离组氨酸，采集信号20min

17、，得到CEC谱图如图所示。重力进样用pH5.5缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L组氨酸L-组氨酸溶液8s。在6.0kV的分离电压下，以pH=5.5的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液作运行液，采集电导信号20min，得到CEC谱图如图所示。重力进样用pH6.0缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L-组氨酸8s。在6.0kV的分离电压下，以pH=6.0的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液作运行液，采集电导信号，得到CEC谱图。重力进样用pH6.0缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L-组氨酸8s。在6.0kV的分离电压下，以pH=6

18、.0的2mmol·L1磷酸盐缓冲溶液作运行液时， 由于电流太小，所以不能实现分离。D,L-组氨酸CEC图和D,L-组氨酸L-组氨酸CEC图都是运行缓冲液在pH5.5时的谱图。比较两图中组氨酸对映体对应的两个峰面积之比，即可确定D型与L型。在图中，保留时间较短的峰与保留时间较长的峰面积之比A1：A22.2，在加入L-His后的图中，保留时间较短的峰与保留时间较长的峰面积之比A1：A26.8。可见加入L-His后，保留时间较短的峰面积相对增大了，可知LHis比D-His的保留时间小。图 pH5.5下D,L-组氨酸毛细管电色谱图 图 pH5.5下D,L-组氨酸L-组氨酸毛细管电色谱图比较p

19、H5.5的图和pH=6.0下的毛细管电色谱图，可看出运行缓冲溶液pH值对分离的影响。缓冲溶液pH值对组氨酸对映体的分离效果比较如表所示。表 缓冲液的pH值对分离结果的影响缓冲液pH L组氨酸tR（min） L组氨酸tR（min） 分离度R5.5 6.23 6.68 1.06.0 5.02 5.56 0.4当使用较高pH值（pH6.0）的缓冲液作运行液时，保留时间比使用较低pH值（pH5.5）的缓冲液作运行液时早，并且分离度下降。该结果于所选的手性选择剂BSA性质是相符的。由于BSA的等电点pI4.7。当pH5.0时，由于接近非常BSA等电点，使BSA表面负电荷很小，因而电渗流太小，导致分离不能

20、实现。缓冲液的pH值越高，BSA 离解的负电荷越多，使正的电渗流越强，于是使保留时间更早。同时，由于正的电渗流越强，使CEC的两种保留机理溶质在固定相和流动相之间的分配差异和待分析物电泳淌度的差异之中，后者起主导作用。而手性分离是依靠BSA与对映体的作用强弱有所不同使对映体得到拆分的，属于溶质在固定相和流动相之间的分配差异的分离机理。因而pH值的增大使分配作用来不及很好地进行，待分离对映体就被带出，从而使分离度下降。四 结语在GMA基质整体柱上以环氧基法键合BSA制成的手性整体柱，分离组氨酸对映体的最佳pH条件大致在pH5.5。当pH值降低时，虽然有可能使分离度提高，但会由于pH接近BSA的等

21、电点（pI4.7）而使电渗流降低，延迟出峰时间，从而丧失CEC的高效特性。而当pH值升高时，则会导致分离度下降。致谢中山大学化学院创新研究基金参 考 文 献1Rangan Mallik，Tao Jiang，David S. Hage. High-Performance Affinity Monolith Chromatography: Development and Evaluation of Human Serum Albumin Columns. Anal. Chem. 2004, 76： 7013-7022.2胡 健，张乐之，罗 平等. 性药物消旋体拆分的研究进展. 西南国防医药. 20

22、05，15：105-107.3罗明可. 现代色谱法在手性药物拆分中的应用进展. 福建医药杂志. 2004，26， 157.4叶明亮，邹汉法，刘 震等. 开管毛细管电色谱进展. 分析测试学报. 1999，18（1），78.5施治国，冯钰锜，达世禄. 溶胶 凝胶技术制备毛细管硅胶整体柱及其应用.分析化学学报. 2003，19（6）， 503-506.6王霞，李永民 ，陈立仁. 毛细管电色谱整体柱制备新进展. 化学研究. 2005，16：108-112.7Antonella Messin*, Miroslav Flieger, Fiorella Bachechi et al. Enantiosepa

23、ration of 2-aryloxypropionic acids on hiral porous monolithic columns by capillary electrochromatography Evaluation of column performance and enantioselectivity. Journal of Chromatography A, 2005,11(107):1-6.89主沉浮，林秀丽，魏云鹤. 毛细管电色谱及其在手性药物分离中的应用. 中国生化药物杂志.2003，24（4），2004.10张正行.有机光谱分析.北京：人民卫生出版社,1995.68

24、80.Preparation of Capillary Electrochromatography Column Immobilized by BSA and its Application to Histidine EnantioseparationWU Pin-Duan，MA Zhi-Ling*(School of Chemistry & Chemical Engineering, Sun Yat-sen University,Guangzhou,510275,China)Abstract Monolithic column is a novel type of medium for