一例凝血因子ⅧB区错义突变导致重型血友病A

1、    一例凝血因子B区错义突变导致重型血友病A        摘要目的：检测一例重型血友病A患者(SH9)的基因突变。方法：用PCR、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和DNA测序检测因子基因突变。先用Southern blotting排除内含子22倒位，然后应用PCR对凝血因子基因进行扩增。扩增范围包括所有外显子及其侧翼内含子序列。结果：片段14-2在DGGE中泳动异常。DNA测序证实C2535A导致B区错义突变826Asp(GAC)Glu(GAA)。结论：该突变可能是导致重型

2、血友病A的原因，但有待进一步研究证实。关键词变性梯度凝胶电泳DNA测序错义突变凝血因子血友病A A novel missense mutation in the B domain of Factor causes severe hemophilia ALiu Jianxiang, Zhang Yuzhou, Wang Hongli, et al. Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai200025AbstractObjective:To ide

3、ntify the genetic defect of a patient with severe hemophilia A (SH9). Methods: PCR, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and DNA sequencing were used to screen mutations in the factor gene. Intron 22 inversion was excluded previously by Southern blotting with F8A probe. PCR primers were de

4、signed to cover all the coding regions and flanking intron sequences. Amplified products were analysed with DGGE, and bands of abnormal mobility were directly sequenced. Results: PCR fragment 14-2 showed slower mobility than normal. A single nucleotide substitution C2535A causing a missense mutation

5、 in the B domain, 826Asp(GAC)Glu(GAA) was identified by DNA sequencing. Conclusion: This nucleotide substitution may be the molecular etiology of SH9. The possible molecular mechanisms underlying this candidate mutation is yet to be clarified.Key wordsDenaturing gradient gel electrophoresisDNA seque

6、ncingMissense mutationCoagulation factor Hemophilia A血友病A为最常见的遗传性出血性疾病，发病率为1/(500010000)(男性)，是由血浆凝血因子(F)缺陷所致。编码F的基因位于Xq28，全长186kb，含26个外显子。成熟的 F蛋白由2332个氨酸酸残基组成，可分为6个结构域，即3个A区(A1、A2、A3)，2个C区(C1、C2)和1个B区，排列成A1-A2-B-A3-C1-C2。经凝血酶作用后B区被切除，形成由A1/A2/A3-C1-C2组成的活性形式1。缺失B区的重组F促凝活性不变。目前还不清楚B区的具体生物学功能2。病例和方法1病

7、例患者SH9经本院测定血浆FC(一期法)为0.7%、vWFAg(免疫火箭电泳法)为108.8%，诊断为重型血友病A。44例无亲缘关系的血友病A患者亦用同法诊断。110名正常人DNA标本来源于体检学生和健康献血者。采ACD抗凝全血，按常规方法抽提白细胞高分子量DNA。2聚合酶链反应(PCR)应用Bio-Rad公司软件MacMelt对待测DNA序列进行分析，根据解链温度曲线确定PCR引物位置3。先设计25对引物扩增除外显子14的所有外显子及其侧翼内含子序列4。14号外显子另设计8对引物(见附表)分别扩增。在每对引物中的一个引物的5端加一“GC-clamp”，使PCR产物一端形成Tm较高、不易解链的

8、“夹子”。PCR反应体系同前4。片段14-2的PCR反应条件为：94 1分钟，56.5 1分钟，72 1分钟，35个循环，72延伸7分钟。3变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析应用D GENETM System(Bio-Rad公司)，片段14-2的DGGE条件为：聚丙烯酰胺凝胶浓度为7.5%，变性剂浓度梯度范围30%60%(40%甲酰胺加7%尿素为100%变性剂浓度)，电泳温度58，电压150V，电泳时间810小时。4DNA测序在DGGE电泳中发现异常条带，则将条带割下，溶于双蒸水中，用相同引物再进行PCR反应，用Taq DyeDeoxTM Terminator Cycle Sequencing

9、kit(Applied Biosystems)对PCR产物用荧光标记后，在ABI377测序仪上进行直接测序。正链和反链序列均同时检测。结果患者SH9扩增片段14-2在DGGE电泳中泳动比正常明显减慢(1)。DNA测序结果表明在826号密码子上发生了一个碱基置换C2535A，导致B区错义突变826Asp(GAC)Glu(GAA)(2)。经查询最新文献及F基因突变数据库，这一突变在国内外尚未见报道。另对44例无亲缘关系的血友病A患者及110名正常人所做的相同检测，未发现这一碱基置换。    15为正常人对照；610为血友病A患者；患者SH9的14-2条带泳动

10、明显减慢1片段14-2的变性梯度凝胶电泳结果附表14号外显子扩增引物外显子5端引物3端引物扩增片 段长度位置14-1GTAACCAGAGTCTTATTCTTCCT(GC)-TTCTGGAATTGTGGTGGCATTA265bp-234614-2TAGCACTAGGCAAAAGCA(GC)-TGATGGAATTGTTGAAAT429bp2302-273014-3AACAGAGTTGAAGAAACTTGA(GC)-CCAGACTGATGGACTATTCTCA684bp2462-314514-4GAAAGACTCACATTGATGGCC(GC)-GCTTGGAAAAACCATCTC479bp3090

11、-356814-5(GC)-AAGGGTGAATTTACAAAGGACTGTTTCTTCTAGTGGGAG517bp3517-403314-6CAGAATTTTGTCACGCAACGT(GC)-AGTCATCTCCAAGGTTAGAAT450bp3967-441614-7(GC)-GTCCAAGAAAGCAGTCATTCTGATTGCTTTCACAAGCGTTCAGG542bp4340-488114-8TGGAAATCCCAAGAGAAGTCACCA(GC)-AGCAGAGCAAAGGAATAACCA357bp4796-       

12、  在F基因的2535位核苷酸发生了CA碱基置换，导致826Asp(GAC)Glu(GAA)错义突变A为正常对照；B为血友病A患者SH92患者SH9片段14-2的DNA测序结果讨论缺失B区的F促凝活性与野生型相当，说明B区并非F功能活性所必需5。我们先用F8A探针排除了内含子22倒位6，然后筛查除14号外显子以外的所有编码序列及侧翼内含子序列，未发现异常4。为此我们又设计了8对引物扩增14号外显子，发现14-2片段在DGGE电泳中泳动异常，经3次重复测序证实826Asp(GAC)Glu(GAA)突变。为排除多态性的可能，我们对110名正常人和44例无亲缘关系的血友病A患者同

13、时进行PCR-DGGE检测，均未发现这一碱基置换。现已知F基因点突变中B区点突变共13种，其中6种为无义突变，其余7种为错义突变7。其中一例1242Asp(GAC)Glu(GAG)突变导致重型血友病A，与SH9相似。Kamisue等8在狗血友病A模型中发现B区909SerGlu突变，也导致重型血友病A。错义突变导致重型血友病A的具体分子机制还不清楚。最近，Liu等9首次报道一例马凡氏综合征患者FBN1基因外显子51中一个静止突变(氨基酸未改变)C6354T导致mRNA剪接错误，使整个外显子51丢失(exon skipping)，其发生机制不明。剪接错误一般由于剪接位点的绝对保守序列或套索分支点

14、(lariat branch point)区域的突变影响剪接体的组装所致。碱基置换产生新的剪接位点(cryptic splice site)也可使mRNA前体的拼接发生错误。此外，剪接位点邻近的核苷酸序列也有一定的保守性，对正确的剪接也有作用10。编码区点突变使整个外显子丢失大多见于无义突变，说明保持完整读框在剪接过程中也发挥一定作用9。826Asp(GAC)Glu(GAA)突变距两端剪接位点有相当距离，不可能影响剪接体的结合组装。对两侧翼序列分析表明，这一碱基置换并没有产生新的剪接位点。这一突变是否确实影响mRNA剪接还有待进一步研究。目前还不能确定在未被检测的内含子、F基因的调控序列或其他

15、位点中是否还有突变。志谢：对提供最新F基因点突变数据库的EGD Tuddenham教授、ST Antonarakis教授及G Kemball-Cook博士表示感谢参 考 文 献1Gitchier J, Wood WI, Goralka TM, et al. Characterization of the human factor gene. Nature, 1984, 312:326-330.2Antonarakis ST. Molecular genetics of coagulation factor gene and haemophilia A. Thromb Haemost, 1995

16、, 74:322-328.3Myers R, Maniatis T, Lerman M. Detection and localization of single base changes by denaturing gradien gel electrophoresis. Meth Enzymol, 1987, 88:501-527.4刘建湘，张宇舟，王鸿利，等. 应用DGGE检测中国人血友病甲基因突变. 中华血液学杂志，1997， 18：464-467.5Erik B. Second generation,B domain deleted recombinant factor . Thro

17、mb Haemost, 1997, 78:256-260.6张宇舟，邵慧珍，王鸿利，等. 重型血友病甲凝血因子基因内含子22倒位的研究. 中华血液学杂志，1995，16：454-456.7Kemball-Cook G, Tuddenham EGD. The factor mutation database on the world wide web: the heamophilia A mutation, search, test and resource site. HAMSTeRS update (version 3.0). Nucleic Acids Res, 1997, 25:128-132.8Kamisue S, Cameron C, Notley C, et al. A candidate mutation in the factor B domain as a cause of severe canine ha