大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究

1、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化试验是分子克隆的重要试验之一,但目前实验教材和其他参考书中都采用大量制备感受态细胞方法(常规方法。几乎所有高等学校的实验教材所提供的试验方案中,都需要大容量高速冷冻离心机,有的还要用到超低温(-80冰箱1。由于普通实验室缺乏这些设备,所以该试验很难开设。另外,在实际操作中,由于感受态细胞的转化效率受到诸多因素的影响,如离子强度、热击参数、培养条件、保存温度及时间等2,转化效率很不稳定。很多实验室采取不同的方法来提高感受态细胞的转化效率,但由于这些方法重复性差或所用药品昂贵,应用并不普遍,而且冻存的感受态细胞转化率大大降低。几年来,笔者经过反复试验,总结出一种少量制

2、备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法,介绍如下。1材料与方法试剂:浓度0.1mol/L CaCl2溶液;100mg/ml氨苄青霉素,均为国产分析纯。仪器:数显恒温水浴摇床(上海博迅实业有限公司; 721分光光度计(上海尤尼柯仪器公司;恒温培养箱(上海博迅实业有限公司。培养基:LB液体培养基,1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉, 1%NaCl,蒸馏水配制;LB固体培养基,1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl,1.5%琼脂粉,蒸馏水配制。1.2方法液,37下振荡培养至光密度OD600值0.30.6,分别取菌液2 ml于离心管中,冰上放置10min;4000r/min离心10min,去上清,回

3、收细胞;加冰冷的浓度0.1mol/L CaCl21ml悬浮细胞,立即置冰上放30min;于4条件下4000r/min离心10min,回收细胞;用冰冷的浓度0.1mol/L CaCl2600l悬浮细胞,保存备用(感受态细胞冰浴放置4h以上及时转化,或-70保存,或-20在3周以内转化率较高3。粒对照组,取200l浓度0.1mol/LCaCl2溶液加入装有100l 质粒DNA的离心管中,混匀并在冰上放置30min;将各反应管立即放到42循环水浴12min,取出立即冰浴2min;向各管中分别加入1ml预热(37的LB液体培养基,37缓慢振荡培养1h;将培养液分别均匀涂布在含抗菌素Amp r和不含抗菌

4、素Amp r平板的LB固体培养基上,置于恒温培养箱中,37培养1216h(先在室温下正向放置20min,使液体被吸收,再倒置于平皿37培养。若将上述经培养的转化反应液铺板后,长出的菌落太密,则可进行适当梯度稀释后再铺板,铺板操作需在无菌超净台中进行,待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养,并统计每个培养皿中菌落数。转化体总数=菌落数×稀释倍数×(转化反应原液总体积/涂板菌液体积4大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究黄永莲,黄真池(广东湛江师范学院,广东湛江524048摘要目的提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。方法根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌

5、感受态细胞并高效率转化质粒的方法。结果利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.30.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100300倍。结论该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。关键词感受态细胞;大肠杆菌;制备;转化中图分类号Q939.121文献标识码A文章编号0517-6611(200811-04450-02Study on the Mini!preparation Method and Transformation Conditions f

6、or the Competent Cells of Escherichia coliHUANG Yong!lian et al(Zhanjiang Normal College,Zhanjiang,Guangdong524048Key words Competent cell;Escherichia coli;Preparation;Transformation基金项目广东省自然科学基金项目(5011730;湛江师范学院科学研究基金资助项目(L0607。作者简介黄永莲(1962-,女,重庆人,实验师,从事分子及细胞生物学技术研究。收稿日期2008(02(04(上接第4449页酶基因在大肠杆菌中

7、的表达J.农业生物技术学报,2007,15(1:147-152.14张艳禾,张兰威,胡森,等.Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在毕赤酵母中的表达J.浙江大学学报:农业与生命科学版,2006,32(5:505-510.15张琳,曹健,陈金朋.微生物亚油酸异构酶的生物信息学分析J.河南工业大学学报:自然科学版,2007,28(2:55-59.转化效率=转化子总数/质粒DNA 加入量同时比较常规方法与试验方法的转化效果。2结果与分析2.1培养皿内菌落生长状况转化试验组含抗菌素平板上长出的菌落即为转化体,质粒对照组无受体菌,质粒DNA 不能单独存活,不长出菌落;受体

8、菌对照组在不含抗菌素平板上有大量菌落长出,在含抗菌素平板上无菌落长出,是因为E.coli DH5在含抗生素(氨苄青霉素的培养基上不能生长,说明该试验未产生抗药性突变株;而转化试验组在两种条件下都能长出菌落,是因为质粒DNA 具有抗药(氨苄青霉素性(表1。2.2试验方法与常规方法转化效果比较表2表明,少量制备大肠杆菌对感受态细胞所选取的OD 600nm 值并不是十分严格,在0.30.6均可达到高转化率的效果,而常规方法在转化时对感受态细胞OD 600nm 值要求严格,一般以氯化钙法大量制备大肠杆菌感受态细胞OD 600nm 值多采用0.400.505。试验组Test group 不含抗菌素平板P

9、late without bacteriophage 含抗菌素平板Plate with bacteriophage受体菌对照组有大量菌落长出无菌落长出质粒对照组无菌落长出无菌落长出转化试验组有大量菌落长出有菌落长出表1培养皿内各试验组菌落生长状况Table 1Colony growth status of each test group in petri dishes质粒Plasmid OD 600=0.305OD 600=0.416OD 600=0.503OD 600=0.602常规方法Conventional method 试验方法Test method 常规方法Conventional

10、method 试验方法Test method 常规方法Conventional method 试验方法Test method 常规方法Conventional method 试验方法Test methodpUC192.01×1062.82×1082.51×1064.16×1082.31×1064.15×1082.02×1062.81×108pGEM1.26×1061.23×1081.69×1062.65×1081.56×1063.18×1081.92

11、15;1061.90×108表2常规方法和试验方法重复所得转化率的平均值Table 2Mean of the obtained transformation rate by conventional method and test method使用常规方法进行转化,每微克超螺旋质粒可产生106个转化菌落,而该试验所用的方法每微克超螺旋质粒可产生108个转化菌落,转化率提高了100300倍。3结论与讨论(1试验结果表明,对质粒DNA 的最优转化条件为:感受态细胞所选取的OD 600nm 值在0.30.6且感受态细胞于-4放置424h 及时转化,或-20在2周内转化效率高;整个过程都需置

12、细胞于冰上,热休克时间为12min ,转化是DNA 扩增和在体内进行基因研究的关键步骤。一般认为,冰冷氯化钙溶液处理可使细菌进入“感受态”,而热休克则使细菌的细胞膜张开,这样DNA 得以进入细胞,转化的质粒DNA 浓度为200l ;感受态细胞加入质粒DNA 2ng 左右,转化率与所加DNA 浓度在一定范围内成正比,但当加入的DNA 量过多或体积过大时,则会使转化率下降6。该试验在转化DNA 时改用5ml 离心管装,是因为细菌培养要有一定的空间,在转化后可直接在离心管里加入LB 液体培养基摇匀,无需另换试管,减少操作过程中的污染。(2一般培养基中必须含有原平板筛选转化子所用的抗生素,以维持对质粒

13、有无的选择,部分质粒在长期无筛选压力的生长条件下会从宿主菌体内丢失,因为那些偶然丢失了质粒后能以耗能小的方式复制的细菌将会淘汰那些携带质粒的细菌7。(3扩增的质粒可以用小量法从培养基中制备,通常在这个时刻要制备培养物的保存液,方法是将培养物分散于含有一定浓度的甘油溶液中冻存,甘油的作用是保护细胞免受冰晶形成的伤害8。(4试剂的质量与污染对试验效果有一定影响,因此,所用的试剂如CaCl 2等应是高质量的,且最好保存于4的冰箱里。整个过程需要注意防止杂菌和其他DNA 的污染,所用器皿如分装用的微量离心管、吸头、试剂瓶等都要高压灭菌,试验中凡涉及溶液移取、分装等敞开实验器皿的操作,最好在无菌超净台中

14、进行以防污染9。(5该方法放宽了试验条件,OD 600nm 值在0.30.6均可得到较高的转化率,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究,相对于电击转化方法简便、稳定性好;相对于高感受态细胞制备,节约了试验成本;相对于经典氯化钙法简化了操作流程、节约了试验时间,是从事基因克隆研究方面科研人员的良好选择。参考文献1张岚岚,徐春燕,徐昌杰.大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素J.细胞生物学杂志,2004(26:429-432.2谢志雄,刘义,陈向东,等.大肠杆菌HB101感受态的热化学研究J.化学学报,2000,58(2:153-156.3涂知明,陈明洁,何光源,等.三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化J.华中科技大学学报:自然科学版,2006,34(4:112-115.4刘进元.分子生物学实验指导M.北京:清华大学出版社,2002:22-29.5魏群.分子生物学实验指导M.北京:高等教育出版社,1999:51-55.6李振宇,徐开林,潘秀英,等.氯化铷法