环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究--学位论文

1、环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究-学位论文 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 摘要米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen)是中国沿海常见的赤潮原因种之一,能够产生溶血性毒素和鱼毒素,对沿海水产养殖业构成巨大威胁。氮磷生理生态学研究表明环境中硝酸盐与磷酸盐浓度的升高对于米氏凯伦藻的增殖具有显著的促进作用。但是,关于硝酸盐与磷酸盐如何影响米氏凯伦藻的光合作用、核酸合成以及蛋白表达并进而影响藻细胞增殖与赤潮形成的深层机制仍有待研究。 本实验以 f/2 培养基(Guillard,1975)为基础,配制氮胁迫、磷胁迫以及含

2、氮磷对照培养基培养米氏凯伦藻。隔天计数藻细胞密度并同时测量培养基中的硝酸盐与磷酸盐浓度值,得到不同培养条件下米氏凯伦藻种群增殖曲线与营养盐浓度变化曲线,对数据进行重复测量并进行多重性分析与相关性分析。用流式细胞仪测定氮胁迫、磷胁迫与对照组米氏凯伦藻细胞周期发展与叶绿素荧光强度变化,得到不同培养条件下米氏凯伦藻种群细胞周期发展情况与叶绿素荧光强度变化情况直方图。对于不同培养条件下提取的藻细胞蛋白样品采用 SDS-PAGE偶联 MALD TOF/TOF或 LTQ Orbitrap XL二级质谱鉴定对应的蛋白种类表达情况,得到不同培养条件下米氏凯伦藻差异蛋白表达情况,根据差异蛋白功能阐释分析米氏凯伦

3、藻在蛋白层面对环境氮磷胁迫影响的响应机制。 对氮胁迫、磷胁迫以及氮磷对照培养条件下米氏凯伦藻细胞密度变化数据、硝酸盐与磷酸盐浓度变化数据、叶绿素荧光强度数据、细胞周期数据以及蛋白表达差异的分析表明: (1)环境中硝酸盐与磷酸盐对/增殖的 spearman 相关系数 0.968,高浓度磷酸盐(19?mol/L)的变化与米氏凯伦藻种群增殖的 spearman 相关系数 0.991。 (2)环境中硝酸盐的缺乏(3.7?mol/L)对于米氏凯伦藻单位细胞叶绿素荧光强度影响不显著(p>0.05);环境中磷酸盐的缺失(0.77?mol/L)会使米氏凯伦藻单位细胞叶绿素荧光强度显著下降(p<0.

4、05),小粒径米氏凯伦藻亚族群形成,细胞光合效率下降。 (3)环境中硝酸盐的缺乏(3.7?mol/L)对于米氏凯伦藻细胞 dsDNA 合成以及细胞周期的发展具有显著抑制作用(p<0.05);环境中磷酸盐的缺乏(0.77?mol/L)对于米氏凯伦藻细胞 dsDNA合成以及细胞周期的发展具有非常显著的抑制作用(p<0.01) 。 (4)环境中硝酸盐的缺乏(3.7?mol/L)致使米氏凯伦藻细胞 16 种蛋白表达上调被MALDI TOF/TOF 与 LTQ Orbitrap XL检出,分析差异蛋白功能认为米氏凯伦藻在硝酸盐转运、氮缺失信号转导、氨基酸代谢、遗传信息保护以及溶血素毒素产生等

5、方面对硝酸盐缺乏产生了一系列的响应。与硝酸盐缺乏培养相比,含氮对照培养的米氏凯伦藻细胞中 11I 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 蛋白表达上调被 MALDI TOF/TOF与 LTQ Orbitrap XL检出,分析差异蛋白功能发现在硝酸盐充足情况下,米氏凯伦藻参与光呼吸、增殖,蛋白质修饰成熟,基因组与细胞骨架稳定性以及相关信号转导蛋白表达上调。 (5)环境中磷酸盐的缺乏(0.77?mol/L)致使米氏凯伦藻细胞 11 种蛋白表达上调被 LTQ Orbitrap XL检出,分析差异蛋白功能认为米氏凯伦藻通过相关信号转导、液泡磷释放、自身磷脂降解、有

6、机酸合成以及吞噬营养等方面对磷酸盐缺乏产生了一系列的响应。与磷酸盐缺乏培养相比,含磷对照的米氏凯伦藻细胞中 4 种蛋白表达上调被 LTQ Orbitrap XL 检出,分析差异蛋白功能发现在磷酸盐充足情况下,米氏凯伦藻参与细胞增殖、正常糖酵解、SAM 循环及多胺合成蛋白表达上调。 (6)在硝酸盐缺乏培养下的藻细胞蛋白中鉴定到溶血素蛋白 calcium binding hemolysin protein(gi|254513175) ,在米氏凯伦藻赤潮溶血性毒理效应中起重要作用。 (7)在两组对照实验蛋白样品中都检出了细胞分裂周期蛋白 cell division cycle protein 48

7、Thalassiosira pseudonana CCMP1335(gi|224001990) ,在米氏凯伦藻种群增殖与赤潮形成过程中起重要作用。关键词: 米氏凯伦藻;细胞密度;叶绿素荧光强度;细胞周期;差异蛋白组;响应机制II 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 Abstract删除的内容: bloom Karenia mikimotoi Hansen is one of the most important harmful algal species in the Chinese 删除的内容: alongcoasts, which could pr

8、oduce hemolytic toxins and ichthyotoxins, resulting devastating economic 删除的内容: a删除的内容: and causeloss. Previous studies demonstrated that the increase of environmental nitrate and phosphate concentrations could promote the growth and reproduction of K. mikimotoi. Researches on intrinsic mechanisms r

9、egarding the effects of nitrate and phosphate on the K. mikimotoi photosynthesis, nuclear acids replications and differential proteins expressions remain to be carried out删除的内容: M Culture medium, made up by synthetic water including N-limited, P-limited and f/2 were 删除的内容: , applied to culture K. mi

10、kimotoi. Cell counts and nitrate or phosphate concentration assay were 删除的内容: used删除的内容: sperformed every other day. The data were analyzed by multi-comparison and corralation 删除的内容: availablemethods. Flowcytometry was applied to measure the population cell cycle evolution and chlorophyll fluorescen

11、ce intensity of this species. The data were executed one-way ANOVA analysis. SDS-PAGE tandem MALDI TOF/TOF or LTQ Orbitrap MS/MS spectrometry was employed to identify differential proteomics expression. Accoding to illustrated functions of differential proteins, proteomics mechanisms response to nit

12、rate or phosphate stress were estimatedExperimental data analysis elucidated conclusions were as follows: The elevation in environmental nitrate or phosphate concentrations imposed significant promotion on the growth of K. mikimotoi. High concentration 32?mol/L variations of nitrates spearman correl

13、ation coefficient with growth of Karenia mikimotoi was 0.968, while high concentration 19?mol/L variations of phophates spearman correlation coefficient with growth of Karenia mikimotoi was 0.991Chlorophyll fluorescence intensity of K. mikimotoi didnt decrease significantly p>0.05. in the nitrate

14、 stress condition3.7?mol/L. Environmental phosphate stress 0.77?mol/L imposed significant drop on its chlorophyll fluorescence intensity p<0.05. The environmental phosphate stress rendered the emergence of reduced apical axis length subpopulation and low efficiency of photosynthesisEnvironmental

15、nitrate stress 3.7?mol/L inhibited the replication of dsDNA significantly p<0.05, while environmental phosphate stress 0.77?mol/L prevented the replication of dsDNA remarkably p<0.01Environmental nitrate stress 3.7?mol/L brought about expression rise of 16 species of III 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米

16、氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 proteins which were identified by MALDI TOF/TOF and LTQ Orbitrap XL spectrometryInvestigations of differential proteins functions demonstrated the proteomic mechanism of Kmikimotoi response to nitrate stress, which was composed of nitrate transportation, nitrate stress signal transd

17、uction, amino acid metabolism,nuclear acids protection and the production of hemolysin protein. In contrast to nitrate stress culture, 11 species of proteins were expressed greatly in nitrate sufficient culture. Analysis of differential proteins functions demonatrated the proteomic mechanism of K. m

18、ikimotoi response to nitrate sufficiency which included photorespiration, reproduction, protein accelerating maturity, genome and cytoskeleton stability and nitrate sufficiency signal transductionEnvironmental phosphate stress 0.77?mol/L brought about expression rise of 11 species of proteins which

19、were identified by LTQ Orbitrap XL spectrometry. Investigations of differential proteins functions demonstrated the proteomic mechanism of K. mikimotoi response to phosphate stress, which was composed of phosphate stress signal transduction, vacuolar phosphate release, phospholipid degradation, orga

20、nic acid composition and phagotrophyContrary to phosphate stress condition, 4 species of differential proteins were identified. Analysis of these proteins functions demonstrated the proteomic mechanism of K. mikimotoi response to phosphate sufficiency which included cell reproduction, flourishing na

21、tural glycosis, SAM cycle or polyamine productionHemolytic calcium binding hemolysin protein gi|254513175 was indentified only in the nitrate absent condition, which exerted important influence on the hemolytic effect of Kmikimotoi algal bloomsCell division cycle protein 48 gi|224001990 was indentif

22、ied in both control experiments, which impacted the growth of K. mikimotoi fundamentallyKeywords: Karenia mikimotoi; cell density; chlorophyll fluorescence intensity; differential proteomics; response mechanismIV 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 目录 摘要.I AbstractIII 目录V 第一章 绪论.1 1.1 米氏凯伦藻形态分类特征

23、.1 1.2 米氏凯伦藻赤潮的广泛发生及毒素研究.1 1.3 米氏凯伦藻氮磷营养生理生态研究2 1.4 植物对环境氮磷的分子生物学响应机制.3 1.4.1 植物 NO ?吸收与同化代谢途径.4 31.4.2 植物 NO ?信号转导及氮胁迫响应4 31.4.3 植物磷吸收代谢途径.5 1.4.4 植物磷胁迫响应机制.6 1.5 海洋藻类分子生物学研究进展.7 第二章 材料与方法.9 2.1 实验材料.9 2.1.1 实验藻种9 2.1.2 主要设备仪器.9 2.1.3 主要试剂.10 2.1.4 主要试剂配制方法10 2.2 实验方法 11 2.2.1 米氏凯伦藻氮、磷缺失培养实验 11 2.2

24、.2 米氏凯伦藻细胞密度与营养盐浓度测定12 2.2.3 米氏凯伦藻蛋白质提取.12 2.2.4 蛋白质浓度测定.12 2.2.5 蛋白样品的 SDS-PAGE.13 2.2.6 凝胶蛋白的切取.13 2.2.7 蛋白质酶解13 2.2.8 LTQ Orbitrap XL质谱分析14 2.2.9 MALDI TOF/TOF质谱分析.14 2.2.10 流式细胞仪测定米氏凯伦藻细胞周期与叶绿素荧光强度14 2.2.11 数据分析15 第三章 结果与分析16 3.1 硝酸盐与磷酸盐对米氏凯伦藻种群增殖的影响.16 3.2 硝酸盐与磷酸盐对米氏凯伦藻叶绿素荧光强度的影响.19 3.3 硝酸盐与磷酸盐

25、对米氏凯伦藻细胞周期的影响.21 3.4 硝酸盐与磷酸盐对米氏凯伦藻蛋白表达的影响.24 3.4.1 硝酸盐对米氏凯伦藻蛋白表达的影响.24 3.4.2 磷酸盐对米氏凯伦藻蛋白表达的影响.29 3.5 米氏凯伦藻赤潮溶血素蛋白分析32 3.6 米氏凯伦藻细胞分裂蛋白 TpCDC48 分析33 第四章 讨论39 4.1 细菌的干扰和影响39 4.2 米氏凯伦藻生理生化需求对氮磷吸收策略的影响.40 V 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 4.3 磷胁迫下米氏凯伦藻糖酵解机制探讨40 4.4 米氏凯伦藻对硝酸盐、磷酸盐胁迫的分子响应机制探讨.41 4.5

26、研究展望42 第五章 结论44 参考文献46 附录.51 在校期间发表论文及科研成果.110 致谢 111 VI 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 第一章 绪论1.1 米氏凯伦藻形态分类特征 1935 年在日本京都 Gokasho 湾首次发现米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hasen) ,当时定名为 Gymnodinium mikimotoi,中文译名为米氏裸甲藻,之后该甲藻赤潮在世界各地的温带、亚热带及亚寒带海区都曾出现,属于广温广盐赤潮藻,其曾用名包括 Gymnodinium nagasakiense、 Gyrodinium au

27、reolum和 Gymnodinium cf. nagasakiense等。 2000 年, Daugbjerg等根据裸甲藻的超微结构以及部分 LSU rDNA测序信息将米氏凯伦藻从裸甲藻属独立出来1建立 Karenia 属,相应的 Gymnodinium mikimotoi 改名为 Karenia mikimotoi ,中文名译为米氏凯伦藻。 米氏凯伦藻隶属于甲藻门,裸甲藻目,凯伦藻属。细胞绿褐色,圆形至椭圆形。背腹扁平,有时会形成细胞大小明显不同的亚族群。上锥部半球形至宽圆锥形,在顶端处有一顶沟,自纵沟上端延伸至顶部并达背面。下锥部的底端有凹陷。横沟位于中央或略前,左旋,纵沟从横沟处开始到

28、底端。核椭圆形至豆形,位于细胞左侧。10-20 个叶绿体散生于2细胞中,细胞长 18-37?m,宽 14-35?m 。Hansen 对其超微结构分析发现它含有核室,具有核膜的特征,并且在鞭毛组织中有核纤维连接细胞核与纵向微管的根部,在纵向鞭毛中3含有层状纤维,具有显著的腹侧突出和不透明物质 。1.2 米氏凯伦藻赤潮的广泛发生及毒素研究 我国有关于米氏凯伦藻的昀早记录是 1986 年发生在厦门西港区的疑似米氏凯伦藻赤4潮 。由于近年来富营养化程度的加剧以及国际航运的发展,我国沿海赤潮呈现出频率高、时间长、范围广、危害大、新记录和有毒种类增多的趋势。其中米氏凯伦藻就是属于我国危害较大的赤潮原因种。

29、1998 年 3-4 月,广东珠江口及香港海域发生特大规模的米氏凯伦8藻赤潮,赤潮期间,赤潮生物密度达 0.63-7.60×10 个?升。此次赤潮给整个粤港地区海5水养殖业造成高达 3.5 亿元的重大经济损失 。2005 年在我国渤海以及东海的长江口外海6域都曾发生大规模米氏凯伦藻赤潮,使当地的网箱养殖鱼类大量死亡 。从全球地理分布来看,米氏凯伦藻主要分布在大西洋东北部、欧洲沿岸和日本,此外,在美国东部沿海地区和加拿大的部分海域也有发现。1992 年,在美国东部沿海南大西洋有米氏凯伦藻赤潮发生。1993年,加拿大奎北克省沿岸和圣劳伦斯海湾米氏凯伦藻赤潮也首次出现,当时的水温为 4-1

30、8,盐度为 17-29。在欧洲,米氏凯伦藻赤潮出现在从挪威的 Senja岛至西班牙的 Galician 的广阔海域,但不包括像英吉利海峡和凯尔特海域这样的混合水域。1995 年,1 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 在法国的大西洋沿岸,米氏凯伦藻赤潮爆发,导致 800-900 吨的翡翠贻贝(Mytilus edulis)死亡,另外还造成大量其他鱼类的死亡。在欧洲海域米氏凯伦藻赤潮爆发的盐度一般在730-36,或是 25(如在 Kattegat),有时甚至更低在 9左右 。 米氏凯伦藻赤潮危害鱼类、无脊椎动物,引起养殖生物的大量死亡,主要是由于米氏凯藻

31、赤潮存在溶血性毒素和鱼毒素,溶血性毒素和鱼毒素作用的部位为鳃弓、鳃耙、鳃丝8及鳃小片,有溶解鳃组织细胞的作用 。对于毒素的分子结构的分析,Satake 等从米氏凯伦藻中分离出两种具有细胞毒性的多聚醚 Gymnocin-A 与 Gymnocin-B,采用核磁共振(NMR)和 CID MS/MS分析测定 Gymnocin-A结构中含有 14 个相邻的醚环和一个 2-甲基-2-丁烯侧链,而 Gymnocin-B 的分子结构中含有 15 个相邻的醚环和一个 2-甲基-2-丁烯侧9,10链 。Seki 等研究了米氏凯伦藻产生的裸甲藻素(Gymnodimine) ,它是一种五环衍生物,具有一个 C24 羧

32、酸和一个稠环丫嗪,分子式为 C H NO ,包含 5 个甲基,9个亚甲基,932 45 411个次甲基和 7 个季碳 。Parrish等分析了由米氏凯伦藻所产生的糖脂,其含有 17%的单半12乳糖二甘油酯和双半乳糖二甘油酯,而这种糖脂被认为可能是藻毒素的生物活性前体 。1.3 米氏凯伦藻氮磷营养生理生态研究 米氏凯伦藻赤潮的发生与海区的富营养化程度以及海水中磷酸盐的含量有着很大的关系,对 2005 年发生在我国福建海域的米氏凯伦藻赤潮研究发现:赤潮期间营养指数 E长期维持在较高水平,E的峰值高达 140;当磷酸盐浓度为 15.5 mol/L,海区米氏凯伦藻10 cells/L,研究人员推测米氏

33、凯伦藻细胞密度与营养指数以及磷细胞密度达到峰值 1.98×10酸盐浓度呈正相关性,在磷酸盐充足的富营养化海域,米氏凯伦藻具有一定的竞争优势,13容易形成赤潮 。在实验室培养条件下,黄凯旋研究环境氮对于米氏凯伦藻细胞增殖的影响,发现米氏凯伦藻能以氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠和尿素为氮源,而不能利用甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸和 1,4-丁二胺盐酸盐。以外海天然海水为介质,在分别以氯化铵、硝酸钠、14亚硝酸钠和尿素为氮源时,米氏凯伦藻生长的昀适 N/P 比分别为 32、32、100 和 32 。李正峰研究米氏凯伦藻磷营养生理生态证实米氏凯伦藻可以吸收利用溶解态无机磷(DIP)?磷酸二氢钠(NaH

34、PO )和有机磷(DOP)?三磷酸腺苷二钠盐(ATP)和甘油磷酸钠2 4(G-P),且在高磷条件(低氮磷比)下比低磷条件(高氮磷比)生长的好。米氏凯伦藻对溶解态无机磷的吸收半饱和常数 Ks 为 0.26 M,比绝大多数甲藻都要低;亲和系数 为15417.6,比绝大多数甲藻都要高,所以米氏凯伦藻对介质中 DIP 的竞争能力很强 。 国外学者研究环境因子对米氏凯伦藻生长的影响起步较早,Yamaguchi 等报道对于不2 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 同的氮和磷的底物,米氏凯伦藻的 Ks 值小于其他甲藻,表明米氏凯伦藻仅需要很低浓度16的营养盐来维持其

35、增殖,这使得它在自然环境下能比其竞争者更快的增殖 。Holligan 等发现米氏凯伦藻能在营养已耗尽的水域积累氮,使得细胞中的氮含量超过冬季硝酸盐氮的17昀高浓度 。 Le Corre等测定了在米氏凯伦藻赤潮形成时的 Ushant锋面的分层水域营养盐-2 -1 -2 -1浓度,发现铵的吸收速率(3.75mmol?m ?h )远高于硝酸盐氮的吸收速率(0.4mmol?m ?h ),-2 -1在 Ushant 锋面的分层水域的铵的再生速率(3.4mmol?m ?h )也比整个海域的平均再生速-2 -1 18率(0.2mmol?m ?h )高 。在米氏凯伦藻赤潮形成初期,无机氮的量不可能是充足的,因

36、为之前的硅藻赤潮已经将其耗尽,所以 Gentien 推测米氏凯伦藻增殖所需氮的 90%是以铵的形式被吸收,而这些铵几乎全是由微型异养生物(d30?m)分解之前的硅藻残体所提7供 。Videau 等报道硅藻赤潮藻体的分解与米氏凯伦藻赤潮的爆发之间通过腐胺的作用而发生联系,腐胺是由鸟氨酸和精氨酸脱羧而合成,然后腐氨在多胺聚合酶的作用下进一步19合成精氨与亚精氨,而精氨与亚精氨对于细胞的分裂增殖很重要 。Hirayama等报道当培养基中的无机磷耗尽后米氏凯伦藻的碱性磷酸酶活性增强,从而使其能利用一些有机磷20。 随着人们对海区有机、颗粒形态营养盐重要性及浮游植物生理活动多样性认识的加深,吞噬营养在海

37、洋浮游植物寡营养生存竞争以及海洋赤潮形成过程中的作用逐渐得到重21视 。吞噬营养(phagotrophy)发生的具体表现是细胞内部食物泡或是外源性质粒或细胞22,23器等结构的存在 。同属裸甲藻目的一些甲藻种类如环沟藻(Gyrodinium galatheanum)、23,24红色赤潮藻(Akashiwo sanguienum)等已被证实具有混合营养特征(mixotrophy) 。而米氏凯伦藻也被怀疑具有吞噬营养特征,但尚无实验证实这一猜测。1.4 植物对环境氮磷的分子生物学响应机制 甲藻细胞曾经一度被看作是间核生物(mesokaryote),主要是由于其缺少组蛋白与核小体,其 DNA碱基 G

38、+C 含量高,且含有修饰性或稀有碱基,如 5-羟甲基尿嘧啶(HOMeU)6 6代替胸腺嘧啶(T) 、 N -甲基腺嘌呤(N -MeA)代替腺嘌呤(A)以及 5-甲基胞嘧啶(5-MeC)25代替胞嘧啶(C) ,此外其基因组存在非编码重复性 DNA 序列等 ,于此,对于甲藻基因组的测序工作尚未完成,从而使得对于氮磷影响甲藻基因转录和蛋白表达的研究较少进行。关于甲藻硝酸盐磷酸盐吸收转化以及信号转导途径等分子生物学过程的研究很少,而对于高等植物特别是如水稻、西红柿、拟南芥与豆类植物等氮磷元素转运体系基因的转录与翻译,氮磷代谢吸收同化途径各种酶类表达量与活性调控,氮磷信号在植物体内的转导3 暨南大学硕士

39、研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 途径研究已经比较成熟。米氏凯伦藻作为一种海洋浮游植物在进化学上与这些高等植物关系相对较为亲密,藻体与高等植物蛋白同源性相对其他物种较高。因此可以在高等植物氮磷吸收转化的分子机制成熟的基础上研究米氏凯伦藻细胞对环境氮磷营养因子的响应机理。1.4.1 植物NO ?吸收与同化代谢途径 3氮素是蛋白质、核酸、磷脂等植物生长发育必需的有机化合物的构成元素,这些有机化合物都是植物活体细胞赖以生存的结构与功能组份,因此氮素也被称为生命的元素。由+于无机氮素在细胞内转化过程中所生成的 NH 或 NO 在植物细胞如叶片细胞积累都具有4 226毒害

40、作用 ,环境中的各种形式的无机氮,植物吸收利用率昀高的是 NO 。外界环境中的3?NO 首先经过位于植物细胞膜上的 NO 转运体转运至胞质内,高等植物中存在着 3 个主要3 3?的 NO 吸收转运体系:高亲和 NO 吸收转运系统(HATS)、低亲和吸收转运系统(LATS)3 3?和双亲和吸收转运系统(DATS) ,当生长介质中 NO 浓度较低时,根系吸收 NO 主要依3 327赖于 HATS,当生长介质中 NO 浓度高于 1mmol/L是主要依赖于 LATS 。NO 在细胞质3 3内首先在硝酸盐还原酶(NR)的催化下,以 NADH 或 NADPH 为电子供体被还原成 NO ,2+然后 NO 在

41、亚硝酸盐还原酶(NiR)催化下被还原为 NH ,该反应在根细胞中的电子供体2 428为 NADH或 NADPH,在叶肉细胞中则是以铁氧还蛋白(ferredoxin, Fd)为电子供体 。+NH 与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)催化下生成谷氨酰胺。谷氨酰4胺与 -酮戊二酸在谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶(glutamine-oxoglutarate amino transferase, GOGAT)的催化下,以 2 分子还原型铁氧还蛋白(Fd )为电子供体反应形成 2 分子谷氨red酸,谷氨酸上的氨基可以通过各种转氨酶的作用形成 -酮戊二酸和对应的各种氨

42、基酸(如天冬氨酸 Asp 等) ,从而进入氨基酸循环。同时在氮同化过程中形成的 -酮戊二酸既可以作为 GS/GOGAT 循环中氨基受体,自身也是 TCA 循环中的重要成员,从而沟通了碳氮代谢。1.4.2 植物NO ?信号转导及氮胁迫响应 3Crawford于 1998年提出了 NO ?既可作为植物生长的营养物质又可作为信号调节植物329生长发育 。NO ?作为信号可以调节氮代谢过程中一些关键酶的基因转录与翻译,同时也3可以通过控制细胞内的氮代谢酶蛋白修饰而调节其催化活性。此外 NO ?作为信号可以诱3导糖代谢途径有机酸代谢水平的变化。从而在信号转导途径间发生交叉,形成信号传导网络。对于 NO

43、?的信号转导与感受,植物体内存在一系列级联双组分信号转导体系。典型34 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 的双组分体系由两部分组成:感受组氨酸激酶(sensory histidine kinase)和反应调节子(response regulator)。以蛋白质之间磷酸化状态的转移发挥信号转导的功能。NO ?信号通3过包括双组分转导体系在内的信号转导网络可以影响高等植物的碳同化过程以及根部分30生组织的发育等生理过程 。培养在 0.2mmol/L NO ?的野生植株中硝酸盐还原酶基因3(NIA)、亚硝酸盐还原酶基因(NII)、谷氨酰胺合成酶(GLN1)

44、和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)的转录水平低,但 ADP-葡萄糖磷酸酶(AGPS2)大亚基的转录水平却比27培养在 12mmol/L NO ?条件下的高 。 31.4.3 植物磷吸收代谢途径 在自然环境中磷缺乏是限制植物生长的一个非常重要的因素,磷元素是植物正常生长和代谢所必须的物质。包括植物的信号转导、光合作用、呼吸作用和生物分子的合成等均2 3有磷元素的参与。植物吸收的磷主要是正磷酸盐形态,包括 H PO ?、HPO ?、PO ?,其2 4 4 4中以 H PO ?昀易被吸收。植物中存在高亲和与低亲和两种磷的吸收机制,植物主要靠高亲2 4+和磷酸转运体获取磷元素,其能量由 H -A

45、TPase 形成的跨膜质子浓度梯度来提供。已分离到的磷酸盐转运体系统包括真菌地衣球囊霉(Glomus versiforme)的细胞跨膜磷酸盐转运31-33体基因 (GVPT)、 拟南芥 AtPT1-AtPT6的磷酸盐转运体、 衣藻的 CrPT1磷酸盐转运体等 。吸收进植物细胞中的磷以两种形式存在:有机磷和无机磷,无机磷主要以钙、镁和钾等阳离子的磷酸盐形式存在;有机磷则主要以核酸、磷脂和植素等形态存在,此外细胞内各种信号转导蛋白以及蛋白酶的功能活性都与其自身的磷酸化状态有关。研究表明根细胞或表皮细胞吸收的磷进入皮层后,其中的 30%-50%在数分钟甚至几秒钟内就进入代谢。昀先合成的有机磷是 AT

46、P,此外还有 6-磷酸葡萄糖(G6P) 、6-磷酸果糖(F6P)、1,6-二磷酸果糖27(FDP)和磷酸甘油酸(PGA)等 。根吸收的磷通过转移到达植物的各个组织,在叶片中磷参与光合作用,将 CO 转化为葡萄糖,进而合成蔗糖和淀粉,同时在光合磷酸化作用2中,形成 NADPH 和 ATP,其中 NADPH 是 NO ?同化所必需的。磷促进糖从叶绿体中运输3出来,以磷酸酯的形式(如蔗糖磷酸酯)运送到植物体的各个部分。蔗糖或淀粉在磷酸化酶的催化下分解为葡萄糖,参与葡萄糖在细胞内的酵解(glycolysis)的许多酶类都受到细胞磷含量水平以及自身磷酸化的调节。生成的 6-磷酸葡萄糖(G6P)可以通过戊

47、糖磷酸途径形成核糖-5-磷酸,参与几种核苷酸的生成,进而脱氧形成脱氧核苷酸,参与核酸与脱氧核酸的合成。5 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 1.4.4 植物磷胁迫响应机制 植物细胞的细胞质与液泡是植物细胞的重要磷库。在养分充足时,液泡一般可容纳细胞内磷总量的 85%-95%。这个库不起代谢作用,而是缓冲因环境中磷水平的瞬间波动而引27起的胞质内磷的波动 。在环境磷缺乏而引起胞质磷匮乏时,液泡膜对磷的通透性增加,液泡中的磷释放到胞质中,只有当液泡中的磷完全耗尽时,胞质中的磷水平才开始下降,34并伴随各种缺磷挽救机制 。植物磷饥饿可快速诱导磷酸转运体的转

48、录激活,使细胞膜上磷酸盐转运体数量增多,转运体对磷酸盐的亲和力提高,同时细胞质膜对磷的通透性降低35以减少渗漏到环境中磷的数量 。在磷胁迫下,高等植物中普遍发生酸性磷酸酶(APase)活性增强,植物 APase能够释放磷酸盐和土壤中难溶矿质中的磷,从而提高环境中的磷含量,另外酸性磷酸酶能水解植物体内的磷脂化合物(如磷酸胆碱),加快磷代谢循环,以36弥补外源性磷源的供应不足 。缺磷抑制光合作用可通过三个方面进行:对类囊体中电子传递的直接作用;对卡尔文循环几种关键酶的抑制;通过类囊体膜两侧的 pH 梯度27或电子载体的氧化还原状态的反馈抑制 。磷匮乏影响叶绿体的光能转换和利用。研究表明低磷处理使玉

49、米叶片中 PS过度还原,PS关闭程度显著增加,激发光通过 PS进入37光化学过程的量显著减少,光能转换效率降低,过剩激发能增加 。同时缺磷也阻碍了由磷酸转运体进行的基质内磷酸丙糖的输出,导致叶绿体中磷酸丙糖积累,而不能使植物同化物质进行有效分配,从而影响作物生长。磷缺乏使糖酵解途径中的一些关键酶的活性受到影响,Stephen 等的研究表明不依赖磷与腺苷酸的胞质酶磷酸果糖转移酶(PFP)在磷胁迫条件下可取代正常状态下磷酸果糖激酶(PFK)所催化的由果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-二磷酸的反应;磷独立的非磷酸化的 NADP-3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADP-G-3PDH)在磷缺乏时可取代正常状态下磷

50、酸化 NAD-3-磷酸甘油醛脱氢酶(NAD-G-3PDH,)催化的由 3-磷酸甘油醛生成 1,3-二磷酸甘油酸的过程;另外磷饥饿使黑芥悬浮细胞诱导产生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)磷酸酶,并催化由磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的过程,而在磷充足情况下该反应由丙酮酸激酶(PK)催化进行。据此,Stephen 等提出了磷饥饿的糖酵解支路(包括 3 个旁路) ,具体如图 1 所示。 此外磷的亏缺造成体内磷、ATP、ADP、2,6-二磷酸果糖和可溶性蛋白含量降低,而游38离氨基酸含量提高 6 倍 。在严重缺磷的情况下 RNA 则成了可利用磷源的一个重要来源。在缺磷的西红柿细胞中,大量的胞内、胞外核糖核酸酶(R

51、Nase)被诱导产生,RNase 催39化的 RNA分子降解可产生几种化合物,尤其是磷,有助于缺磷植物的生存 。 另外,植物中磷营养与硝酸盐的吸收、共生固氮作用紧密相关。缺磷豆科植物中硝酸6 暨南大学硕士研究生学位论文 环境氮磷因子对米氏凯伦藻分子生态学特征的影响研究 盐的吸收显著减少,吸收的硝酸盐从根到茎的转运也减少。这有可能是磷胁迫下茎中氨基40酸的积累引起的反馈抑制的缘故 。 ATP ADP ATPADP葡萄糖-6-磷酸 果糖-6-磷酸 葡萄糖 果糖-1,6-二磷酸己糖激酶 磷酸葡萄糖 磷酸果糖激酶异构酶 (PFK) 磷酸果糖转移酶(PFP) PiPPi ATP ADP NADNADH果

52、糖二磷酸 醛缩酶 3-磷酸甘油醛 1,3-二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸磷酸化NAD-3-磷酸甘油醛 3-磷酸甘油酸激酶脱氢酶(NAD-G-3PDH) (3-PGA) 非磷酸化的NADP-3磷酸甘油醛 脱氢酶(NADP-G-3PDH) NADP NADPHADP ATP丙酮酸激酶 (PK) 丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)磷酸酶 PiH2O图 1 糖酵解及磷饥饿的糖酵解支路(Stephen et al. 1989) Fig.1 Glycolysis and phosphorous starvation bypass of glycolysis 实线为正常条件下的糖酵解途径,虚线表示3个磷胁迫条件下的糖酵解支路1.5 海洋藻类分子生物学研究进展 由于拟南芥(Arab