茶多酚对木瓜蛋白酶的络合作用及特性的影响

1、茶多酚对木瓜蛋白酶的络合作用及特性的影响第lO期(总第79期)2006年lO月农产品加工?学刊AcademicPeriodicalofFarmProductsProcessing?77?No.1O0ct.文章编号:16719646(2006)10007704茶多酚对木瓜蛋白酶的络合作用及特性的影响陈晓燕,姜绍通,蔡静(合肥工业大学生物与食品工程学院,合肥230009)摘要:茶多酚对木瓜蛋白酶具有络合作用.以茶多酚为原料,采用BoxBehnken设计法,优选出茶多酚与木瓜蛋白酶络合的最佳条件,并在此基础上研究了木瓜蛋白酶在络合前后性质的变化,包括酶的热稳定性和抗氧化性.结果表明,茶多酚对木瓜蛋白

2、酶的活力回收率高达99.01%;木瓜蛋白酶在络合后热稳定性有所增强,热失活速率由1.025min降低至1.010min;络合后的酶对邻苯三酚自氧化过程的抑制率由10.1%增加至16.4%,其抗氧化性明显增强.经HPLC分析发现,茶多酚中有3种单体与木瓜蛋白酶发生络合作用,其中以EGCG含量最高.关键词:木瓜蛋白酶;茶多酚;络合;热稳定性;抗氧化性中图分类号:3"3272.2文献标志码:ATheEffectofTea-polyphenolonComplexionandPropertiesofPapainChenXiaoyan,JiangShaotong,CaiJing(Schoolof

3、BiotechnologyandFoodEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China)Abstract:Tea-polyphenolWaSusedtocomplexpapain.Takingtea-polyphenolasmaterial,thebestconditionofthecomplex-ionforteapolyphenolandthepapainWaSchoseinthewayofBoxBehnkenforthisstudy.Andonthefoundation,thevarietyofpapain'Sp

4、ropertyWaSstudied,forexamplethethermalstabilityandantioxidantactivity.Theresultsshowedthattherecov-eryrateoftheactivityWaSupto99.01%;thethermalstabilityofpapainWaSimprovedaftercomplexionwithteapolyphenol,theactivitylosingrateconstantWaSloweredfrom1.025minto1.010min;andwiththecomplexing,theinhibition

5、rateincatechol'SoxidizeprocessWaSincreaSedby10.1%to16-4%.theantioxidantactivityWaSstrengthenedobviously.ByHPLCanalysis,therewerethreekindsofmonomersinthetea-polyphenolwithTPCpapain,theEGCGcontentWaSthehighest.Keywords;papain;teapolyphenol;complex;thermalstability;antioxidantactivity0引言茶多酚具有抗氧化,清

6、除体内超氧阴离子自由基,抗癌,防癌和降血脂等优异功能,以及纯天然,高效能,无毒副作用等显着特点.我国卫生部已批准了茶叶天然抗氧化剂为我国的食品添加剂之一,并已应用到油脂和肉类等食品加工上【1.木瓜蛋白酶在食品及其他工业具有广泛应用,但其热稳定性差使其应用受到较多限制,因此现阶段木瓜蛋白酶的应用关键在于木瓜蛋白酶的稳定化.茶多酚表现出很强的抗氧化活性,它与蛋白质的络合特性将有助于改善木瓜蛋白酶等含巯基的蛋白酶在室温下被氧化而失去活性的性质21.本文主要研究的是茶多酚与木瓜蛋白酶的络合作用,并对络合前和络合后的木瓜蛋白酶性质进行研究,从而为进一步研究茶多酚与木瓜蛋白酶的络合物在实际生产上的应用提供

7、依据.1材料与方法1.1木瓜蛋白酶和茶多酚的络合作用将木瓜蛋白酶(广西南宁庞博生物工程有限公司产品)分别用pH值为6.0,7.0和8.0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制成2mg/mL的溶液,然后将茶多酚(无锡绿宝生物制品有限公司产品)按与木瓜蛋白酶的不同质量比添加到50mL酶液中,茶多酚与木瓜蛋白酶的质量比为2:1,3:1和4:1.混合完全后,在特定温度下,放置特定长的反应时间,观察其络合物的混合现象.混浊物用离心机在7500r/min速度下离心10min将其分离,沉淀物用相应的磷酸缓冲液溶解,测定沉淀物的蛋白质含量和酶活,以确定络合反应酶活性回收最高的络合条件.1.2蛋白质含量的测定采用Bra

8、dford法测定溶液中蛋白质的浓度31,以木瓜蛋白酶作为标准蛋白,用721型分光光度计在595nm波长条件下测定吸光度的变化,以蛋白质的浓度对吸光度作图,得到相应的标准曲线.收稿日期:20060821基金项目:科技部星火计划项目(2003EA710034).作者简介:陈晓燕(1979-),女,浙江人,助理工程师,在读硕士,研究方向:食品生物化工.E-mail:swspcxy.农产品加工?学刊2006年第lO期1.3木瓜蛋白酶活性的测定从经济和简便的角度考虑,用紫外光谱法测定木瓜蛋白酶的酶活,该法采用磷酸氢二钠一柠檬酸溶液作为缓冲溶液,使繁琐的操作步骤大为简化,便捷,且试剂易得,该法也广泛适用于

9、其他蛋白酶的活力测定.木瓜蛋白酶在一定的温度与pH值条件下,水解酪蛋白(sigma公司产品),水浴60cc灭酶,然后加入三氯乙酸使未水解的酪蛋白沉淀除去,用UV210I型紫外分光光度计在275nm条件下测定吸光度.根据吸光度计算木瓜蛋白酶活力.木瓜蛋白酶活力单位的定义为:在一定温度和pH值条件下,1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸为1个酶活力单位,以U/g(u,mL)表示51.酶活力计算公式:酶活力(U/g)=A?K?V?凡/(t?m).式中:A样品的吸光度值;K_吸光常数;反应试剂的总体积;,广一酶液的稀释倍数,n=l;卜一反应时间,t取10min;m酶质量,g.2结果与讨论2.1蛋白含量曲线

10、的绘制用Bradford法测定5支试管中的木瓜蛋白酶的吸光度值,并以木瓜蛋白酶浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标得标准曲线,可溶性蛋白的标准曲线见图1.0246蛋白酶浓度mg/mL图1可溶性蛋白的标准曲线由所测数据得可溶性蛋白含量的标准曲线方程为:y=0.2129x+0.0123,R=0.9996,则测得各酶液的A后可由标准曲线算得酶液中木瓜蛋白酶的蛋白含量,从而代人公式算得各个酶活.2.2茶多酚与木瓜蛋白酶络合反应最佳条件的选择本研究采用的BoxBehnken设计法是国际上较为常用的一种响应曲面法(responseSul'faeemethodologY,RSM)61.在实验中分别从4因素

11、(温度,pH值,反应时间,茶多酚与木瓜蛋白酶质量比)3水平中优选出茶多酚与木瓜蛋白酶络合反应的最佳条件.以酶活回收率为目标,通过测定反应后木瓜蛋白酶液的吸光度值,计算各酶液的酶活和蛋白含量,从而计算出茶多酚对木瓜蛋白酶的回收率.经过响应面模型的建立,显着性检验,优化和验证,最终选择温度最佳值为4cc,pH值最佳条件为6.0.随着温度升高和pH值的增大,酶活回收率明显下降.保温时间对酶活回收率的影响不是极其显着,茶多酚与木瓜蛋白酶的质量比在2:1时,考察指标的实测值较高,在模型检验中其平方项表现为显着.络合的最佳反应时间是3.5h.2.3游离木瓜蛋白酶与rip一木瓜蛋白酶的热稳定性比较在较高温度

12、下,测定游离木瓜蛋白酶与rip络合后的木瓜蛋白酶活性随时间变化的情况.实验条件为60cc,每隔30min测定一次酶活力,用紫外光谱法在275nm下测酶液的吸光度A值.实验以6Occ条件下加热时间为横坐标,以游离木瓜蛋白酶和TP一木瓜蛋白酶残留的相对活力为纵坐标作图,60下两种酶的热失活曲线见图2.实验发现,随着受热时间的增加,木瓜蛋白酶的活性明显降低,从总的曲线趋势来看,TP络合后的木瓜蛋白酶活性降低的速率较游离木瓜蛋白酶变慢.又以加热时间为横坐标,酶的相对活力的对数值为纵坐标作热失活动力学曲线,60cc下两种酶的热失活动力学曲线见图3.妲莨鼬谣加热时间t/min一一游离木瓜蛋白酶;_1.r_

13、一rP一木瓜蛋白酶图26O下两种酶的热失活曲线茶多酚对木瓜蛋白酶的热失活具有一定的抑制作用,经过络合反应木瓜蛋白酶的热失活速率有明显的降低,即变性速率减小,半衰期增长.而60下两种酶的热失活动力学曲线表示两种酶随加热时间残留的相对酶活呈线性降低的趋势,游离木瓜蛋白酶的热失活曲线为y一0.0243x+4.772,TP一木瓜蛋白酶的热失活曲线为',一0.0097x+4.558.计算得酶的热失活速率常数游离木瓜蛋白酶为1.025min,TP一木瓜蛋白酶为1.010min.其原因可以用茶多酚的抗氧化性质来解释:茶多酚的高效抗氧化性作用于木瓜蛋白2006年第lO期陈晓燕,等:茶多酚对木瓜蛋白酶的

14、络合作用及特性的影响酶;木瓜蛋白酶的分子结构中具有潘I生的是一个游离的巯基和两个二硫键,两者任意一个被破坏都会引起酶活力的丧失.而巯基很容易被氧化从而导致木瓜蛋白酶在室温或更高的温度下易变性失活,络合反应后酶的抗氧化性增强将使酶稳定性得到改善.7娌谧叶:'蛊圈谧0501013150加热时间tlmin一一游离木瓜蛋白酶;-.r_一TP一木瓜蛋白酶图360下两种酶的热失活动力学曲线2.4热处理对木瓜蛋白酶巯基含量的影响巯基的摩尔浓度Co=A.一14150×3(稀释倍数).用DTNB法每隔30rain测定酶活,计算公式处理原始数据(吸光度值),得到巯基含量.实验结果表明,通过60热

15、处理,随着热处理时间的增加,木瓜蛋白酶的活性及巯基含量逐步减少.热处理对papain巯基含量的影响曲线见图4,热处理对papain活性的影响曲线见图5,由图4和图5比较得到酶热失活与巯基含量的变化具有相同的趋势,此结果证明了木瓜蛋白酶活性部位即为其残留巯基.穹2I咖加=回1O2O4J0608O100l2Ol4o加热时间t/rain图4热处理对papain巯基含量的影响曲线2.5茶多酚,11P一木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶抗氧化性比较采用邻苯三酚/D1Tr终止法81测得茶多酚,TP一木瓜蛋白酶,木瓜蛋白酶对邻苯三酚的自氧化均有抑制作用,每隔0.5min读一次A值,连续记录3min,做线性分析得到邻苯三

16、酚的自氧化率A.,As口,A和A距,再计算样品对邻苯三酚的抑制率,邻苯三酚自氧化速率测定见表1.抑制率=0一As)/A0×100%.掣摆'杂譬圈谧002040608O100120140加热时间t/min图5热处理对papain活性的影响曲线表1邻苯三酚自氧化速率测定游离蛋白酶抗氧化性较弱,在常温或某些物理化学条件下就容易被氧化而变性.而络合后的酶抗氧化性有明显的提高.这与本文2-3提到的木瓜蛋白酶稳定性提高原因相吻合.其原因可能是茶多酚与酶络合后,酶活性中心的巯基部分受到茶多酚的抗氧化性保护,即使在高温环境下酶的氧化过程也有被延缓的现象,所以其稳定性也得到提高.2.6茶多酚和

17、11P一木瓜蛋白酶中儿茶素单体的HPLC定性分析实验用Waters高效液相色谱仪分析茶多酚及TP一木瓜蛋白酶样品,色谱分离条件为:色谱分析柱:SymmetryC18(5um×15em);2996型二极管阵列检测器;检测波长=280nm;流动相为重蒸水/乙睛/乙酸乙酯=86/12/2(体积比);流速为1.0mL/min;AUF=3.091.经检测发现,茶多酚中主要的4种儿茶素单体,分别为表儿茶素(顺式)EC,表没食子儿茶素没食子酸酯(顺式)EGCG,表没食子儿茶素没食子酸酯(反式)GCG,表儿茶素没食子酸酯(顺式)ECG,茶多酚的HPLC分析图见图6.经检测并与茶多酚的分析图比较发现,

18、TP一木瓜蛋白酶中含有3种儿茶素单体,但是各个组分的含量已经大大减少,其中以EGCG含量最高,TP一木瓜蛋白酶的HPLC分析图见图7.因为EGCG是酯型儿茶加舳加65432lOm%2222222lllll?8O?农产品加工?学刊2006年第lO期素,其分子中有2个能与酶蛋白络合作用的活性基团:一个是醅酰基,另一个是羟苯基.由于这些活性基团,使儿茶素能以氢键的形式与酶蛋白络合,从而形成浑浊和沉淀ll01.3种单体的抗氧化性能力,以强至弱顺序为EGCG>ECG>EC,因此作为抗氧化性最强的儿茶素单体,EGCG与木瓜蛋白酶的结合最多,使酶抗氧化性大大增强,这与其热稳定性提

19、高也相吻合.2.502.001.501.0o0.50O.0o0.030O.O2OO.OlOO.0()oEGCG一4.820GCG一5.930EGC一11.339EC一3.5O0_LLL上J上J2.0o4.0o6.0o8.0olO.0ol2.0o图6茶多酚的HPLC分析图IJ.,2.004.006.008.0010.0ol2.0ol4.0o图7TP一木瓜蛋白酶的HPLC分析图3前景展望(1)随着木瓜蛋白酶制品应用范围的不断扩大,其稳定性也需要大大提高,在此方面,茶多酚的添加使之成为络合物,能提高该酶的热稳定陛.首先,茶请读者作者为本刊荐言农产品加工?学刊创办1年多来,在广大读者和作者的关怀与支持

20、下,执为广大读者作者服务之诚,行创办精品科技期刊之本,越来越受到行业的关注,读者群越来越广,期刊的发展正在步/X,if_轨.为了进一步提高刊物质量和扩大社会影响,恳请您百忙之中抽暇为本刊工作提出宝贵意见.1.本刊栏目设置是否合理,有哪些栏目不妥,您建议增加什么栏目.2.编辑,排版,校对有哪些问题,请列出您发现的差错.3.能否及时收到刊物,对本刊的各项服务工作有什么意见.4.您有意为本刊投稿吗?近期有什么撰稿计划.5与本刊有哪些合作意向,对本刊工作有哪些要求和建议.农产品JJnT?学刊编辑部多酚因其具有较强的抗氧化性,可以针对该酶在室温甚至高温下易被氧化这一缺点,增强其抗氧化性,延缓木瓜蛋白酶活

21、性中心的氧化过程.(2)茶多酚是从茶叶中提取的天然产物,使回收后的木瓜蛋白酶能保持其天然的特性,应用范围得到扩展.今后可以在本实验的基础上进行深入的应用研究,对回收后的酶加以实际应用,如做成嫩肉粉】,能增加肉质的嫩度,并能起到肉制品的保鲜作用.参考文献:黄圣基,万青.茶多酚的制备及其在食品工业中的应用【J1.食品研究与开发,1996,17(1):2528.周春晖.豆类抗酶因子钝化及木瓜蛋白酶的TP络合稳定化研究【D】.广州:华南理工大学,2002.李娟,张耀庭,等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量【J1.中国生物制品学杂志,2000,13(2):118120.张寒俊,刘大川,杨国燕.紫外光谱法定量测定不同种蛋白