抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)卵黄免疫球蛋白(IgY.

1、作者：黄清松，罗深秋，林抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)卵黄免疫球蛋 白(IgY) 的制备与性质研究 08-07-29 10:58:00 元 编辑： studa0714黄清松，罗深秋，林元藻，曾位森【摘要】 目的 观察鸡卵黄中抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA) 抗体的含量、纯度、来源及稳定性。 方法 用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)作为抗原免疫 Leghorn 鸡；通过改良 水稀释法提取卵黄中的 IgY ；双紫外光波长测定抗体含量 ,SDS PAGE电泳检测 抗体纯度； Western

2、 blot 免疫印迹法测定该抗体来源； ELISA 检测 IgY 对温 度、酸碱度的稳定性。结果 抗体含量 13.3 mg/mL 蛋黄液, 抗体纯度达 96%；免 疫印迹证明 IgY 与鸡血清中的 IgG具有相同的分子量和抗原性； IgY 具有良好 的热稳定性 , 对酸碱具有一定的耐受力。结论 改良水稀释法能得到高产量、高 纯度的特异性 IgY, 而且有良好的生物学活性。Abstract:Objective To observe the yield, purity, source, and stability of the methicillin resistant staphylococcu

3、s aureus (MRSA). Methods Taken the methicillinresistant staphylococcus aureus (MRSA)as antigen immuned Leghorn fowl, IgY was extracted with improved water dilution method. Antibody's content was determined with doublebeam UV/VIS spectrophotometer, and antibody purity was detected with SDS PAGE e

4、lectrophoresis. Antibody 's source was determined by Western blot. IgY ' s constancy to temperature and acidity or alkalinity was determined with ELISA. Results Antibody contained yolk liquid at 13.3 mg/mL; purity of antibody: 96%; immunoblotting showed that IgY and IgG in chicken serum had

5、the same molecular weight and antigenicity, IgY had favorable heat stability and tolerance to acid and base.Conclusion High yield of IgY that had highly purified specificity and favorable biologic activity can be prepared with improved water dilution method.Key words:methicillin resistant staphyloco

6、ccus aureus (MRSA); immunoglobulin of yolk (IgY); antibody免疫球蛋白 (immunoglobulin ) 是具有抗体活性的一种糖蛋白，主要存在于 血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白可分 为 5 类，即免疫球蛋白 G(IgG)、免疫球蛋白 A(IgA )、免疫球蛋白 M (IgM)、免疫球蛋白 D(IgD)和免疫球蛋白 E(IgE),其中 IgG 是最主要的免 疫球蛋白。而母鸡血液中的免疫球蛋白可传递到鸡卵黄中，并且在鸡发育过程中起保护作用，此种免疫球蛋白称为鸡卵黄免疫球蛋白 （IgY） 1。IgG 是存 在

7、于鸡卵黄中的主要免疫球蛋白 ,而 IgM和 IgA 则主要存在于血清蛋白中 2。 IgY 属多克隆抗体，多克隆抗体在疾病的诊断和防治方面具有许多特定 优点，通常一次性大量制备是相当困难的，而多次制备又导致抗体的均一性 差。母鸡一经免疫应答后，可从其卵黄中不断获得特异性的抗体。 IgY 纯度 高、特异性强，不会像其他哺乳动物产生的抗体那样会发生交叉血清反应或过 敏反应, 因而它是最安全的生物制剂，可替代免疫小鼠、豚鼠或兔等哺乳动物所 制备的抗体而大量生产。近年来， IgY 的研究和应用是免疫学领域的热点和十 分活跃的课题。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是引起院内感染的重要致病菌，其 致病性强，对多种抗

8、菌药物耐药，在治疗上十分棘手。本文用耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌作为抗原免疫母鸡制备了抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IgY 3，4，并对其理化性质和生物学活性进行了研究，旨在为其以后的诊断和防治应 用奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 Leghorn 鸡， 25 周龄，购于华南农业大学实验动物中心， 合格证号： 2007A025，常规饲养。1.1.2 试剂 TrisHCl缓冲液；硫酸铵； PBS缓冲液； SDS PAGE成套电泳试剂；考马斯亮蓝 R 250（购自北京索莱宝科技有限公司 ） ；聚苯乙 烯酶标板 （96 孔，浙江黄岩新丰塑料制品厂出品 ） ；兔抗鸡卵黄免疫球蛋白 IgG

9、 （上海生物制品所血液制品室提供）。1.1.3 菌种 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （ MRSA标准菌株 ATCC25923） 获自中国药品生物制品鉴定所。1.1.4 仪器 高速冷冻离心机 （HC 3018R型, 科大创新股份有限公 司） ；电泳仪 （DYY II2 ，北京六一仪器厂 ） ；酶联免疫检测仪（ MR 2000 型，南京思腾医疗器械有限公司）；微量进样器。1.2 方法1.2.1 免疫抗原的制备 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌经接种，摇瓶传代 扩大培养后，收集 MRS，A 用生理盐水反复洗涤 3 次，离心收集置于 0.4%（） 的甲醛溶液中，于 37 24 h 灭活，用 pH7.0 的 0.0

10、1 mol/L PBS 缓冲液洗涤 3 次，将菌液调成 2×109/mL备用。取等量的菌液和不完全福氏佐剂 （ 羊毛脂 液体石蜡 =73）混合，每毫升混合液中加入卡介苗 2.5 mL ，充分乳化后作为免 疫抗原备用。1.2.2 母鸡免疫 12 只产蛋母鸡随机分成实验组和对照组 , 每组 6 只。 实验组每只每次注射 1 mL免疫原，同时注射 4 个部位:双翅膀皮下和左右背部 皮下注射，每周 1 次，连续注射 3周。免疫后第 16 天测定鸡血清 IgG 效价（12 000） ，第 21天开始拣取免疫蛋。对照组用相同方法注射生理盐水。以 后每月强化免疫 1 次。1.2.3 抗 MRSA卵

11、黄免疫球蛋白 （IgY） 的分离和纯化 采用改良水稀释法 （WD）5。步骤如下：打蛋分离收集蛋黄液。以 6 倍双蒸水稀释蛋黄液， 调节 pH值为 5.5 ，4 冰箱放置过夜。离心，弃去沉淀收集上清液。盐 析：上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达 45%，置 4 冰箱静置 8 h 。 离心，弃去上清液，沉淀物按每毫升卵黄液加 5 mL PBS缓冲液 （0.01 mol/L ，pH7.0） 溶解。透析：将溶解液装入透析袋对蒸馏水透析除 NH4+，最 后一次改用对 PBS缓冲液透析。透析液除菌过滤，即得 IgY 提取液。1.2.4 IgY 的抗原性鉴定 用 Western blot 免疫印迹法，二

12、抗为 HRP 酶标兔抗鸡 IgG。1.2.5 IgY 的含量测定采用 260 nm和 280 nm双波长紫外分光光度法。取 2只小试管，甲管加入 1.5 mL IgY 提取液、 1.5 mL 蒸馏水，乙管 加入 3 mL蒸馏水，测定样品在 280 nm、260 nm的吸收值。计算公式：提取液 中 IgY 浓度（ mg/mL ）=1.45A280-0.74A260 。1.2.6 IgY 纯度测定 采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺 （ ）凝胶电泳法测定 6 。凝胶染色后扫描显示其纯度。1.2.7 IgY 的稳定性测定 用 ELISA 法。1.2.7.1 IgY 提取液的预处理 热处理：分别于 25、3

13、7、 50、60、70、 80 水浴内处理 15 min 。酸碱处理：分别置于 pH114，室温处理 3 h。1.2.7.2 稳定性检测 用 ELISA 法，将上述处理过的 IgY 提取液稀释 1 000倍后按下列步骤进行 ELISA检测：将 MRSA用 10%（）甲醛固定过夜后 用pH8.5碳酸盐缓冲液稀释为 3×108cfu/mL。包被 96孔酶联板， 4 下放 置 72 h 。依次加入不同预处理后的 IgY 稀释液（ 每样品各做 2 孔） ；兔抗鸡 IgG（稀释浓度 11 000） ；底物液显色 30 min 后滴加 1滴 2 mol/L 硫酸终止反 应。 490 nm比色。检测所用洗涤液为、pH7.4、0.001 mol/LPBS，阳性对照为未处理 IgY 稀释液，阴性对照为未免疫鸡蛋卵黄提取液物。 结果与分析2.1 IgY 的抗原性蛋黄提取物和鸡血清经免疫印迹试验，显示二者均在高分子量附近出现单 一的特异性酶染色条带，说明卵黄提取物和鸡血清中目的条带均为鸡 IgG 分 子，具有相同的抗原性。表明卵黄中的 IgY 为鸡血清