浅论利凡诺对不同胚层来源细胞增殖能力的影响

1、浅论利凡诺对不同胚层来源细胞增殖能力的影响         【摘要】【关键词】  利凡诺; 人脐静脉内皮细胞; 肝细胞; 成纤维细胞Abstract Objective: To observe the influence of rivanol on growth and proliferation of cells form different germ layers. Methods: After treated by different rivanol concentration(3.13,6.25,

2、12.5 g·ml-1) and different work time(24、48、72 h), morphological changes of cells and rivanol autofluorescence intensity in cells were observed under the fluorescence microscope. With methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method and silver staining nucleolar organizer region(AgNOR) method, the chang

3、e of cell proliferation ability was detected. Results: After 24 h drug treating, the liver cells(BRL3A) and fibroblasts(L929) had no significant morphological changes,while in human umbilical vein endothelial cells(HuVEC) protruding thinner or even disappear, cell growth slowed down. With the increa

4、se of rivanol concentration, cell numbers per unit area gradually reduced. Rivanol autofluorescence strength in three kinds of cells were dosetime dependent increased. MTT results showed that rivanol had a certain degree of inhibition on three cell proliferation, and the inhibition to HuVEC was stro

5、nger than the other two cells(P0.01). After treated with different concentration of rivanol, the reduction of endothelial nucleolar organizing region more pronounced than the other two kinds of cells and the difference was statistically significant(P0.05 or P0.01). Conclusion: The inhibition ability

6、 of rivanol to the proliferation of cells from different sources of the three germ layers was different.Among the three kinds of cells the inhibition to HuVEC cells is particularly notable, suggesting that the rivanol on the inhibition of endothelial cell growth and proliferation is more sensitive.K

7、ey words rivanol; human umbilical vein edothelial cell; liver cell; fibroblast利凡诺(rivanol)由于在终止中期妊娠方面具有良好作用，自1922年被发现以来即受到了广泛关注和研究1-6，而对利凡诺在其他领域的作用研究较少。20世纪90年代，本研究组首先报道了利凡诺的抗肿瘤作用7-9，此后又发现利凡诺对人脐静脉内皮细胞(HuVEC)也具有较强的抑制作用，所以我们推测利凡诺对血管内皮细胞的抑制是其抗肿瘤机制之一，亦即利凡诺可能是一种潜在的血管生成抑制剂。但是目前许多血管生成抑制剂对机体的正常细胞也有较强的毒副作用，不

8、利于长期用药，从而使其抗肿瘤作用的发挥受到很大限制。显然有必要了解利凡诺抗肿瘤作用是泛细胞毒效应，还是对某类细胞有特异的抑制作用。基于此，本实验选择来源于内胚层的正常肝细胞(BRL3A)，来源于中胚层的HuVEC和成纤维细胞(L929)作为实验基础材料，观察不同浓度利凡诺对不同胚层来源细胞的增殖能力的影响是否存在差异性，进一步探讨利凡诺抑制细胞生长的机制及其临床应用的可能性。1 材料和方法1.1 材料1.2 方法1.3 统计学处理数据用x-±s表示，采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，组间比较采用方差分析，P0.05为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 利凡诺对BRL3A、L

9、929、HuVEC细胞形态学的影响 正常状况下BRL3A细胞在倒置相差显微镜下细胞形态呈椭圆形或圆形,呈巢状或漩涡状排列;细胞大小均一,胞浆丰富,胞核较小呈梭形或椭圆形,位于细胞中央;经利凡诺处理后BRL3A形态无明显改变。正常状态下L929细胞体积较肝细胞大，呈长梭形或长椭圆形,条索状或成团生长，胞浆丰富，核圆形位于细胞中央;利凡诺作用后，细胞形态变化不明显，有少量细胞变小变圆变亮甚至漂浮。正常情况下HuVEC呈多角多边形，体积较大，成团或呈铺路石样生长，边缘细胞伸出突起，核小圆形位于细胞中央;利凡诺处理后细胞形态变化较其他两种细胞明显，突起变细变多，但是生长速度变慢，可见大量细胞变小变圆变

10、亮甚至漂浮于培养液中。药物自发荧光主要位于细胞核，而且在L929和HuVEC两个细胞系荧光较强。这种现象随药物浓度的增大和药物作用时间的延长而明显(图1)。         2.2 MTT法检测利凡诺对BRL3A、HuVEC、L929细胞生长的影响 MTT法检测显示,3种浓度的利凡诺在72 h内对BRL3A、L929、HuVEC细胞都有抑制作用,对HuVEC细胞的抑制作用更加明显，L929细胞次之，对HuVEC的抑制作用与同时段BRL3A、L929相比差异均有统计学意义(均P0.01,图2);就HuVEC细胞而言，

11、相同作用时间，不同浓度组间抑制作用均有显着性差异(均P0.05,图3);且这种抑制作用具有时间与浓度的依赖性。与相同浓度利凡诺作用相同时间的HuVEC比较，a P0.012.3 核仁组织区银染法检测利凡诺对BRL3A、HuVEC、L929细胞增殖能力的影响 高倍显微镜下随机计数100个细胞核内平均颗粒数，同时按公式计算相对抑制率。结果显示，利凡诺对HuVEC的抑制作用甚强，其相对抑制率与同条件的L929、BRL3A相比差异均有统计学意义(与L929比较：3.13 g·ml-1，P=0.000;6.25 g·ml-1，P=0.000;12.5 g·ml-1，P=0.

12、003。与BRL3A比较：3.13 g·ml-1，P=0.009;6.25 g·ml-1，P=0.026;12.5 g·ml-1，P=0.009)。当药物浓度达到12.5 g·ml-1时，作用48 h和72 h时间点银染显示HuVEC细胞已无颗粒，而其他两种细胞的颗粒数与各自对照组比尚存60%左右(见图4)。3 讨 论抑制血管生成是目前抗癌研究热点，尽管人们已研发了许多抗血管生成药物，但没有理想者。判断抗血管生成剂优劣的关键是抗肿瘤作用的效果和毒副作用的大小，现有药物尚难做到二者兼顾。人们意识到抑制肿瘤的生长不仅要看肿瘤实质还要看间质，只有把肿瘤细胞、内

13、皮细胞、成纤维细胞作为一个整体来研究才能全面了解肿瘤的生长的规律，才可望从根本上控制肿瘤的生长。而用不同胚层来源细胞进行药物筛选既可以明确药物作用的特异性，又可以推测其毒副作用。基于此，我们不仅研究了利凡诺对血管内皮细胞及同胚层成纤维细胞的生存和增殖的影响，同时还研究利凡诺对与内皮细胞胚层来源不同的BRL3A细胞的生存和增殖能力的影响。结果发现利凡诺对HuVEC细胞的生长状态、生存率以及细胞的增殖能力抑制作用很明显，而对L929抑制作用较弱，对BRL3A细胞的抑制作用则很弱。提示利凡诺可能对内胚层来源细胞的生长增殖影响不大，而对HuVEC细胞的增殖抑制有特异性。其机制尚不清楚，利凡诺是否干预了

14、内皮细胞所特有的VEGFVEGFR细胞信号通路，从A. BRL3A空白组;B. HuVEC空白组;C. L929空白组而抑制内皮细胞生长和增殖，抑或通过其它途径均需进一步研究加以明确。此外还发现利凡诺对成纤维细胞的抑制作用也强于肝细胞，这可能与内皮细胞和成纤维细胞效应通路相似有关。有报道指出内皮细胞(ECV304)SKOV3与(L929)H22细胞在肿瘤新生血管中具有协同作用进而抑制血管生长10。这些实验结论提示利凡诺可能是一种具有良好靶向性的血管生成抑制剂。至于不同细胞对利凡诺的敏感性为什么存在差异，有待进一步探讨。【参考文献】  1 BOZA A V, de LEN R G, C

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