脑缺血再灌注后炎症和自由基作用的实验研究 医学论文

1、    脑缺血再灌注后炎症和自由基作用的实验研究 医学论文              【摘要】     目的 动态观察大鼠脑缺血再灌注后的早期损伤。方法 将100只大鼠随机分为假手术组50只、脑缺血再灌注组50只。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型，脑缺血2 h后再灌注0、6、12、24、48 h取材，假手术组在术后相对应脑缺血再灌注组各时间点取材，免疫组化法测NF?Bp65、IL?1

2、，化学比色法测MDA、SOD，TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果 与假手术组相比，大鼠大脑中动脉缺血2小时后再灌注012 h时MDA含量逐渐增加（P0.000 1)且12 h达高峰，012 hSOD活性逐渐减低（P0.000 1)，024 h NF?Bp65、IL?1蛋白表达及凋亡细胞数逐渐增加（P0.000 1)且24 h达高峰。结论 本实验构建了研究大鼠大脑中动脉缺血2 后再灌注不同时间炎症反应和自由基损伤的实验动物模型，为在最佳时间点观察药物干预自由基和炎症反应提供了实验依据。     【关键词】  脑缺血再灌注；炎症；自由基大量研究已证

3、实脑梗死后脑组织因缺血缺氧会出现酸中毒、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸、炎症因子及自由基生成等一系列的瀑布反应，最终导致细胞死亡或凋亡1，2,故早期干预非常重要。但目前对脑梗死早期的炎症反应尚无明确有效的药物治疗。因此本研究在制作大鼠大脑中动脉缺血模型基础上观察脑缺血再灌注早期炎症反应和自由基生成在时间上的动态变化，寻找各指标的表达峰值，以期为临床选择干预治疗的时机及在最佳时间点观察药效提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验动物 普通级健康雄性Wistar大鼠100只,体重280300 g,由吉林大学动物中心提供，随机分为假手术组、脑缺血再灌注组各50只，分别按脑缺血2 h后再灌注0、

4、6、12、24、48 h分为5个亚组。参照Zea?Longa线栓法3制作大鼠大脑中动脉缺血模型并略加改进，选用市售尼龙鱼线，直径0.28 mm,截取4 cm长的线段若干根,头端用砂纸打磨去除棱角,距头端18 mm和20 mm处各做一标记，酒精消毒,肝素浸泡后烘干备用。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，仰卧固定，常规备皮消毒，颈正中切口，从肌群间向深部分离暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，避免损伤迷走神经，翼腭动脉不予分离,电凝ECA分支，ECA 近心端及远心端挂线结扎,从结扎点间剪断，使ECA远端游离，微动脉夹暂时夹闭CCA 近心端及ICA近心端，ECA残

5、端根部留置丝线备用，在ECA残端根部垂直血管壁剪一小口，与鱼线直径大致匹配，将头端处理过的鱼线插入ECA至分叉处时牵拉ECA残端使其与ICA在一条直线上，继续送入鱼线，移走ICA上的动脉夹，利用鱼线盘绕时形成的自然弧度，将鱼线头端方向对着手术对侧，可避免进入翼腭动脉，当鱼线进入1820 mm且前端遇轻微阻力时停止进线，结扎ECA切口根部固定鱼线，松开CCA的动脉夹，逐层缝合肌肉皮肤,术毕灯照保持鼠体温在37.0左右,缺血2 h后再次麻醉动物,轻轻拔出鱼线至ECA残端实现再灌注。假手术组只是尼龙鱼线插入仅10 mm，其余步骤同手术组。大鼠麻醉清醒后进行神经功能评分，按Zea?Longa35分制标

6、准评分:0分，无神经缺损症状；1分，不能伸展对侧前爪；2分，行走时向偏瘫侧转圈；3分，向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。其中0分和4分者被剔除。凡手术中动物死亡、蛛网膜下腔出血或无对侧偏瘫体征均为模型复制失败，不计在内，用同一批次的大鼠制成合格模型后补足数目。1.2 取材 脑缺血再灌注组分别于再灌注后0、6、12、24、48 h取材，假手术组在相应时间点取材。将假手术组、脑缺血再灌注组各25只用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后，固定于手术台，剪开胸腔，暴露出心脏。以9号穿刺针插入左心室，右心房剪开一小口，首先以生理盐水向左心室注入，冲洗脑组织血管内的血液，至右心房流

7、出的冲洗液转清后，以4%多聚甲醛自左心室灌注固定脑组织，当出现鼠的四肢及尾抖动，表明灌注成功，固定液已进入循环系统。待鼠不再出现四肢及尾的抖动，且躯干僵硬时，立即断头，迅速置于冰盘上取脑，将视交叉后脑组织2 mm厚层面浸泡于4%多聚甲醛缓冲液24 h，然后进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切取同一层面5张切片，切片厚5 m，用于检测核转录因子B p65亚基（NF?B p65）、白细胞介素?1（IL?1）及神经细胞凋亡。另外假手术组、脑缺血再灌注组各25只将距额极211 mm缺血侧脑组织放入9倍量的4生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10的脑匀浆，用离心机3 000 r/min,离心

8、15 min，取上清液分二份立即用于检测丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）。1.3 免疫组化 免疫组化法检测NF?B p65(购自北京博奥森生物技术有限公司)、IL?1(购自武汉博士德生物工程有限公司)，TUNEL(购自上海罗氏公司)法检测细胞凋亡，严格按试剂盒说明书操作，显微镜观察，每只大鼠5张切片选相同部位计数阳性细胞数（400倍），数码相机拍照。NF?B p65和IL?1阳性细胞计数胞浆呈棕褐色着色者。TUNEL阳性细胞为细胞核呈褐色者。 关键词:实验,研究,作用,自由,缺血,灌注,医学论文,脑缺血再灌注后炎症和自由基作用的实验研究 内容摘要:【摘要】 目的 动态观察大鼠脑缺血再灌注后的早期损伤。方