光合细菌双层平板计数方法的研究

1、沈阳农业大学学报,2001-04,32(2):110-112JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2001-04,32(2):110-112光合细菌双层平板计数方法的研究孙军德,赵春燕,李炳学,王(沈阳农业大学,辽宁沈阳110161)垒,陈锡时摘要:通过大量试验,证明双层平板法是光合细菌测数的较好方法。它弥补了传统方法的测数不准确、操作繁琐的缺点。通过正交设计试验,确定影响光合细菌测数的4个主要因素的最佳组合为:底层培养基琼脂含量为0.8%,烤板时间为0.5h,上层培养基温度为50e,上层培养基琼脂含量为1.0%。关键词:光合细菌;双层平板法;计数中图

2、分类号:Q939.1文献标识码:A文章编号:1000-1700(2001)02-0110-03Double-plateCountingMethodofPhotosyntheticBacteriaSUNJun-de,ZHAOChun-yan,LIBing-xue,WANGLei,CHENXi-shi(ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China)Keywords:photosyntheticbacteria(PSB);double-plate;counting光合细菌在养殖业、种植业上的应用日益广泛,近几年,出现了许多光合细菌制剂。为确保

3、这类菌剂的质量,活菌计数极为重要。光合细菌是兼性厌氧菌,常规方法采用71培养基平板计数法计数,但由于长时间光照使培养基表面渗水导致计数不准确,操作复杂且需要特殊的设备。因此,在原有71配方厌氧罐平板计数法基础上,本研究提出了一种适合光合细菌的计数方法)双层平板法,与原有方法相比,这一方法既简便又准确。1#11材料与方法1.1样品来源光合细菌(Rhodopseudomonaspalustris)B9菌液由沈阳农业大学微生物教研室提供。光合细菌菌液(蚌埠生物制品厂产)和固体菌粉(浙江精科生物公司产)从商店购得。1.2培养基1.3菌液稀释采用常规方法对菌液稀释,即用移液管取10mL菌液移于盛有90m

4、L无菌水的三角瓶中,以此类推,将菌液稀释至10,10,10。1.4操作步骤取不同稀释度的光合细菌菌液(一般为10,10,10)0.1mL均匀涂布于光合细菌底层固体培养基上,置4550e下烘去水分后,加入冷却至50e的光合细菌上层固体培养基15mL,置2830e,8001000lx光照下培养56d,测定菌落数。收稿日期:2000-09-04作者简介:孙军德(1963-),男,沈阳农业大学土地与环境学院副教授,硕士,从事微生物学研究。-6-7-8-6-7-8琼脂含量为0.8%,另加0.2%酵母膏。其余同71培养基。琼脂含量为1.0%,另加0.2%酵母膏。其余同71培养基。#p研究报告RESEARC

5、HREPORT第2期孙军德等:光合细菌双层平板计数方法的研究#111#此外,半固体试管法试验按参考文献5,厌氧罐平板计数法试验按参考文献1。1.5光合细菌双层平板法培养条件优化在各因素单因子试验的基础上,选定底层培养基的琼脂含量(A)、烤板时间(B)、上层培养基温度(C)及上层培养基琼脂含量(D)4个主要因素设计4因素3水平正交试验,所设4个因素3个水平见表1。按正交设计试验L9(3)表设计试验,共进行了9组试验,试验组合见表3。表1各因素水平设计Table1ThelevelsoffourfactorsB(H)0.51.02.1结果与分析双层平板计数法与其他方法比较分别采用半固体试管法、厌氧罐

6、法和本方法测定同一菌液,结果见表2。从表2结果可以看出,厌氧罐法和半固体试管法所测得的数量比双层平板法要多,且前两法重复间误差较大,重现性不好。这是因为,厌氧罐法由于长时间光照,培养基渗水造成光合细菌菌落扩散,导致所测定的菌数增加,重复性差,甚至导致菌落成片而无法计数;而半固体试管法虽解决了培养基渗水问题,但由于试管为圆柱体,计数过程中易于造成重复多次计数使所测得的数量多于实际数。本试验确立的双层平板法既解决了培养基的渗水问题,又使所测定的菌落处在同一平面上便于观察计数,从而使测定的结果较为准确。另外,前两种方法所用仪器设备较多,操作比较复杂。表2光合细菌双层平板计数法与其他方法比较Table

7、2Thecontrastbetweendouble-platewithothercountingmethodsofPSB厌氧罐法Anaerobicculture半固体试管法Semi-solidculture双层平板法Double-plateculture实测平均误差(%)实测平均误差(%)实测平均误差(%)RecordAverageErrorRecordAverageErrorRecordAverageError2.2光合细菌双层平板计数方法培养条件优化结果将9组试验在同一稀释度的菌数进行统计分析,结果见表3,分析值见表中的(1)、(2)、(3)行。根据各因子分析值的极差可以看出,各因素的影响

8、大小为上层培养基琼脂含量(D)>底层培养基琼脂含量(A)>烤板时间(B)>上层培养基温度(C)。这说明上层培养基琼脂含量这一因素是主要的,对计数结果影响最大;而底层培养基琼脂含量为第二位因素,它与上层培养基琼脂含量因素的极差相差2.1,说明这一因素也很重要,这在实际测定中已经证明。对各因素的极差进行比较可知,4个因素相应水平的分析值最高的分别为A(2)、B(1)、C(2)、D(1),这说明光合细菌双层平板法最优化的培养条件组合为:底层培养基琼脂含量为0.8%,烤板时间为0.5h,上层培养基温度为50e,上层培养基琼脂含量为1.0%。p研究报告RESEARCHREPORT#11

9、2#沈阳农业大学学报第32卷试验Test123456789分析值(1)Analysis(2)value(3)RTable3ThetesttableoffourfactorsinthreelevelsB烤板时间C温度D上层琼脂含量HouroftoastTemperatureUpperagar菌数PSBnumber8-1(10#mL)Note:Thevaluesin(1),(2),(3)linesaretheanalysisvaluesofallfactorsinrelevantlevel.Ristherangeofanalysisvalues.3小结(1)光合细菌双层平板法是一种简便准确的计数方法,弥补了厌氧罐法和半固体试管法的缺点,结果准确且操作简便。(2)双层平板法的主要培养条件经4因素3水平正交设计试验,确立最优培