高亲和性神经生长因子受体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

1、    高亲和性神经生长因子受体对神经生长因子 诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响        【摘要】目的观察人神经母细胞瘤细胞系IMR-32细胞在恢复高亲和性神经生长因子受体基因trkA表达后对神经生长因子(NGF)诱导分化的反应。方法应用基因重组技术构建含外源trkA cDNA的逆转录病毒载体，经PA317细胞包装后感染靶细胞系IMR-32细胞，经Southern blot杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实转化细胞系中含有外源基因的整合及稳定表达后，

2、进行神经生长因子诱导分化实验。结果转化细胞系未经NGF诱导前与母系细胞在细胞形态及生长状态方面差异均无显著性意义，而经NGF诱导后细胞出现明显神经元样分化，生长及代谢速率减慢(四甲基偶氮唑盐法测定原细胞系IMR-32和空载体转化细胞系IMR-32/pIRV分别为0.258±0.017,0.237±0.011；而trkA基因转化的细胞系则仅为0.028±0.003)，撤去NGF后分化细胞仍然维持分化状态。转化细胞在软琼脂内很少形成集落，集落形成率仅为0.6；远低于原细胞系IMR-32和空载体转化细胞系IMR-32/pIRV 的32.3 和33.6，在裸鼠体内未见肿瘤

3、形成。结论高亲和性神经生长因子受体基因的表达可以使转化细胞系对NGF产生不可逆的诱导分化反应，使肿瘤细胞恶性表型得到逆转。【关键词】神经母细胞瘤；受体，神经生长因子；基因转移；细胞分化Effects of high-affinity nerve growth factor (NGF) receptor gene on NGF-induced differentiation of neuroblastoma cell lineZHE Xiaoning, CHEN Jie(Email:chenj)*, LIU Tonghua, GAO Jie.*Department of Pathology, P

4、eking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100730，China【Abstract】ObjectiveTo study the effects of transfection of high-affinity nerve growth factor receptor gene (trkA) on NGF-induced differentiation of human neuroblastoma cell li

5、ne IMR-32. MethodsThe recombinant retrovirus vector containing exogeneous trkA gene was constructed and packed by PA317 packaging cell line. The neuroblastoma cell line IMR-32 was transfected by virus containing supernatant. The transformant cell line was confirmed by Southern blot and RT-PCR techni

6、ques. The NGF was used to induce cellular differentiation of the transformant cells. ResultsThe trkA gene was successfully transferred and expressed in the neuroblastoma cells. After NGF treatment, the transformant cells displayed apparent neuron-like differentiation morphologically, and a slower ra

7、te of cell growth (MTT value 0.028±0.003) compared with original cell line (0.258±0.017) and empty virus transformed cell line (0.237±0.011). The cells remained in differentiated status after withdrawing the NGF from the medium. The transformant tumor cells rarely formed colonies in s

8、oft agar and failed to form tumor in nude mice. ConclusionRestoration of high-affinity NGF receptor (trkA) expression in neuroblastoma cells could induce non-reversal differentiation. The trkA might be the important factor during NGF-induced differentiation of neuroblastoma cell. 【Key words】Neurobla

9、stoma；Receptors, nerve growth factor；Gene transfer；Cell differentiation神经母细胞瘤是儿童期常见的恶性肿瘤之一。我们实验室以往在对多种人神经母细胞瘤细胞系及其他神经外胚层肿瘤细胞系的研究中发现，缺乏神经生长因子受体（NGFR）表达的细胞系对神经生长因子(NGF)不产生诱导分化反应；即使恢复了低亲和性NGFR在人神经母细胞瘤细胞系IMR-32中的表达，转化细胞经NGF诱导仍然不能发生明显的分化反应。近年来越来越多的实验证据表明，高亲和性NGFR所介导的信号传导通路在NGF诱导包括神经母细胞瘤在内的多种神经源性肿瘤体外培养细胞系

10、分化过程中起到较为重要的作用。我们的研究目的即为观察高亲和性NGFR是否能介导神经母细胞瘤细胞对NGF产生诱导分化反应。材料与方法一、材料含trkA cDNA的质粒pIRV-CMV-trkA及人神经母细胞瘤细胞系IMR-32由美国伍斯特实验生物学研究所Dr.Ross惠赠；小鼠纤维母细胞NIH 3T3、双向性包装细胞系PA317由中国医学科学院医学分子生物学重点实验室提供。TrkA cDNA扩增引物5-CTGGGCGGAGTGCCTGAA-3及5-GGCTGCCGGCTC-CAGGAA-3,扩增片段长度为523 bp1；扩增内参照GAPDH引物：5-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3及

11、5-AGATCCACAACGGATACATT-3,扩增片段长度为309 bp2。以上引物均由北京赛百盛(Cybersyn)公司合成。随机引物标记试剂盒为Gibcol BRL公司产品,逆转录试剂盒为Promega公司产品,-32P-dCTP购自亚辉医学生物工程公司，1.11×105 GBq/mmol, 370 MBq/ml。Balb/c裸鼠及饲料购自中国医学科学院肿瘤医院动物室，裸鼠动物号：01-1004。二、方法1.质粒的构建：含trkA cDNA的逆转录病毒载体经限制性内切酶EcoR酶解，回收线状空病毒载体，经T4DNA连接酶体系连接，恢复其闭环结构，即为pIRV-neo-CMV空

12、载体。2.细胞培养及转化细胞系的建立：IMR-32细胞用含10%胎牛血清的IMDM培养基培养，PA317细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养；将经纯化的上述2种质粒经脂质体法3转染逆转录病毒双向包装细胞系PA317，经G418筛选获得阳性克隆，扩大培养后收集上清，测定病毒滴度4，用高滴度病毒上清转染IMR-32细胞系，经G418筛选获得抗性克隆，扩大培养，转化细胞系分别命名为IMR-32/trkA及IMR-32/pIRV。3.转化细胞中外源基因整合与表达的鉴定：分别提取2种转化细胞系及IMR-32母系基因组DNA及总RNA，应用-32P-dCTP标记的neo cDNA探针行Souther

13、n杂交5，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行目的片段的扩增，实验按试剂盒说明进行操作。4.NGF诱导分化实验：NGF以200 ng/ml作为终浓度，持续给药2周，观察细胞生长分化状况，测定细胞生长曲线，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖代谢率6，常规进行软琼脂集落形成实验7，即每组用2个铺双层琼脂的平皿，接种2×103细胞，培养2周后，分别计数集落数，用2个平皿的平均数除以接种细胞数得出集落形成率；应用Northern 杂交检测NGF作用后细胞中神经丝蛋白mRNA的表达情况。所有实验均以不加NGF，同原细胞系作对照。5.裸鼠体内致瘤性8: 选无致病原雌性4周龄Bal

14、b/c裸鼠，以原细胞系细胞做对照组，空病毒转化细胞IMR-32/pIRV和trkA 转化细胞IMR-32/trkA为实验组。每组34只，无菌条件下饲养，每周换饲料及垫料1次，分别于裸鼠背部皮下接种1×107细胞，4周后开始观察，每周观察1次，并记录肿瘤体积，观察36个月。计算方法如下：V=0.523 6(/6)×a×b2,其中a和b分别为肿瘤在体测量时的最大和最小径线值9。结果1质粒的酶切鉴定结果如1显示，含外源cDNA的质粒经EcoR酶切可得到2.7 kb的cDNA片段及6.5 kb的载体，而空载体酶切后仅出现6.5 kb条带。1：DNA/Hind，2：pIRV

15、-CMV-trkA/EcoR，3：pIRV-CMV/EcoR1pIRV-CMV-trkA及相应空载体酶切鉴定结果1：IMR-32，2：IMR-32/pIRV，3：IMR-32/trkA2Southern杂交鉴定转化细胞系中外源基因整合情况2Southern杂交结果如2显示，在转化细胞中可见前病毒整合，其中空病毒转化细胞杂交带为3.8 kb，为完整前病毒的长度；而trkA转化细胞中由于trkA cDNA 5端距起始300 bp处含有Sac位点，酶切后带neo基因的片段长度约剩3.3 kb，所以杂交带较空载体细胞前移；3结果显示IMR-32/trkA中可扩增出长523 bp的片段，而空载体转化细胞

16、及母系对照中均未见扩增带，各细胞系GAPDH表达能力差别不大，说明RNA总量基本一致。3转化细胞对NGF诱导分化的反应：NGF诱导之前，IMR-32/trkA的细胞生物学行为与空载体转化细胞系及母系无明显差别；在NGF(200 ng/ml)存在的条件下，IMR-32/trkA产生明显分化，包括神经突起生长，胞体聚集(46)，分化反应在给NGF后35 d开始出现，911 d达到高峰，分化细胞经Northern杂交检测发现神经丝蛋白表达上调(7)，MTT法检测细胞增殖代谢率明显降低(表1)。软琼脂集落形成实验结果表明，经NGF诱导分化的IMR-32/trkA细胞集落形成能力显著下降(表2)；加药2

17、周后撤去NGF，分化细胞依然维持分化状态，观察2周亦未见细胞恢复到分化前的幼稚状态，相比之下，空载体转化细胞及母系在NGF作用下未见明显的分化反应，仅有轻微的生长加快，撤去NGF之后继续维持原有的生长状态；转化细胞在裸鼠体内连续观察6个月未见肿瘤形成，而其母系IMR-32和空病毒对照系均在接种的4周时可见明显的肿瘤形成。M：pBR322/Hinf，1：IMR-32，2：IMR-32/pIRV， 3：IMR-32/trkA3RT-PCR检测转化细胞系中外源基因表达情况讨论神经母细胞瘤的发生是胚胎发育过程中神经嵴来源的母细胞在某些阶段分化受阻的结果，而在此过程中，神经营养因子及其相关受体的改变可能

18、不同程度地参与了该肿瘤的发生与发展过程。我们的主要研究内容是基于课题组以往工作成果之上的继续与深入，实验思路以既往研究中两项主要结论为出发点，即（1）NGF不能诱导包括IMR-32细胞系在内的无NGFR表达的神经母细胞瘤细胞分化，尤其是在MYCN基因扩增的情况下10；（2）通过基因重组技术在上述细胞系中恢复低亲和性神经营养因子受体表达之后，转化细胞系仍不能在NGF作用之下出现形态学上的明显分化11，提示低亲和性NGFR所介导的信号传导体系不足以引导神经母细胞瘤细胞发生彻底的终末分化反应，因此，对神经母细胞瘤细胞诱导分化的研究可能通过更有效的途径深入下去。近年来的研究表明，trkA基因的表达产物

19、即高亲和性NGFR所介导的信号传导通路在NGF诱导包括神经母细胞瘤在内的多种神经源性体外培养细胞分化过程中起到较为决定性的作用12，13。因此，观察高亲和性NGFR是否能介导神经母细胞瘤细胞对NGF产生明显的诱导分化反应即成为本研究的目的。46转化细胞系在NGF诱导前后的形态特征，4为IMR-32母系的细胞形态，5为TrkA基因转化后未加NGF的形态，6为TrkA基因转化后的细胞系IMR-32/trkA在NGF处理5 d后，出现明显的形态分化，细胞突起明显延长，胞体变小变圆7Northern 杂交检测转化细胞系在NGF诱导前后神经丝蛋白mRNA的表达情况表1MTT法测定各细胞系经NGF诱导2周

20、后增殖代谢能力细胞系A550 nm(±s)抑制率(%)IMR-320.258±0.0170.00IMR-32/pIRV0.237±0.0110.08IMR-32/trkA0.028±0.00389.10表2各细胞系经NGF诱导2周后软琼脂集落形成能力检测细胞系集落数集落形成率(%)IMR-3265832.3637IMR-32/pIRV68333.6669IMR-32/trkA80.615我们首先成功获得了表达外源基因的转化细胞系，在进一步的NGF诱导分化实验中发现，含有trkA外源基因表达的转化细胞系在NGF的作用之下出现了明显的诱导分化反应，而作为平行

21、对照的IMR-32母系以及空病毒载体转化细胞系均未见分化反应；另外，我们再次平行对照了低亲和性NGFR基因转化细胞系在同一给药条件下对NGF的反应，结果该细胞系仅表现出轻微的分化反应。通过对以上两种分别表达高和低亲和性NGFR的转化细胞系的诱导分化过程的观察，我们发现高亲和性NGFR对NGF诱导神经母细胞瘤细胞分化起到极为重要的作用，这种作用还特别表现在它所介导的分化反应的不可逆性，即诱导神经母细胞瘤细胞发生明显分化后再撤去NGF，已分化的细胞依然能够维持既有的生存状态，在23周的观察期内，细胞不再恢复到原来的幼稚状态，而稳定维持在一种低代谢率的分化状态。转化细胞在软琼脂内集落形成能力明显下降

22、，在裸鼠体内亦不能形成肿瘤。从肿瘤细胞恶性表型得到较为完全的逆转这个角度出发，我们的实验结果具有相当重要的意义，因为这是实现对该肿瘤进行实验性基因治疗的重要和可靠的指标。基金项目：国家杰出青年基金资助项目(39625012)；国家教委跨世纪优秀人才计划基金资助项目作者单位：折晓宁(100730 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院病理科)陈杰(100730 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院病理科)通讯作者：陈杰(Email:chenj)参考文献1 Martin-Zanca D, Oskam R, Mitra G, et al. Molecular and b

23、iochemical characterization of the human trk proto-oncogene. Mol Cell Biol, 1989, 9:24-33.2Ma DD, Wang XM, Wang XH, et al. The expression of GDNF cDNA in nerve and non-nerve cell lines. J Beijing Med Univ, 1997, 29:2-5.3Felgner PL, Gadek TR, Holm M, et al. Lipofection: a highly efficient lipid-media

24、ted DNA transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987, 84:7413-7417.4Palmer TD, Hock RA, Qsborne WR, et al. Efficient retrovirus-mediated transfer and expression of a human adenosine deaminase gene in diploid skin fibroblast from an adenosine deaminase deficient human. Proc Natl Acad Sci U

25、S A, 1987, 84:1055-1059.5Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Eds. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.9.31.6Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods, 1989, 119:203-210.7鄂征. 组织培养技术. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1989.156-158.8Yoshida H, Enomoto H, Tagawa M, et al. Impaired tumorigenicity and decreased liver metastasis of murine neuroblastoma cells engineered to secrete interleukin-2 or granulocyte macrophage colony-st