人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在重组痘苗病毒中的表达及对重组病毒免疫效果的影响

1、    人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在重组痘苗病毒中的表达及对重组病毒免疫效果的影响        【摘要】目的观察人GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)对重组痘苗病毒免疫效果的影响。方法大鼠体内观察。结果从核酸和蛋白水平均证实重组痘苗病毒RVJSB1175D/GM-CSF可同时表达GM-CSF及HSV- 1gD(单纯疱疹病毒gD糖蛋白)，但RVJSB1175D/GM-CSF免疫大鼠产生的抗-HSV1gD特异性抗体水平与RVJSB1175D组相比无显著性差异。结论人G

2、M-CSF在大鼠体内对特异免疫调节作用不明显，可能与GM-CSF主要促使非特异性细胞免疫增强所致有关。【主题词】痘苗病毒人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子单纯疱疹病毒酶联免疫吸附测定 Expression of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF)by recombinant vaccinia virus and its effect on immunogenicityLiu Hongbing,Zhang Zhiqing, Yao Lihong, et al. Institute of Virology,Ch

3、inese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052AbstractKey words:Vaccinia virusHuman granulocyte-macrophagecolony stimulating factorHerpes simplex vrusEnzyme-linked immunosorbent assay将细胞因子导入痘苗病毒已成为研制高效、安全的基因工程多价疫苗有效途径。国内外均有利用痘苗病毒载体成功表达IL-2等多种细胞因子的报道，动物实验表明，细胞因子基因插入痘苗病毒后，对病毒本身的毒力，或对病毒所表达的外源蛋白的免

4、疫效果有明显影响1，2。GM-CSF是一种造血生长的因子，它除促使骨髓前体细胞的增殖、分化、成熟外，还可促使粒细胞、巨噬细胞增殖及其功能增强，从而从不同环节对机体的免疫应答产生影响，是一种重要的免疫调节因子3。迄今国内外有关人GM-CSF在重组痘苗病毒中的表达及对免疫效果的影响尚未见报道。我们构建了可同时表达GM-CSF与型单纯疱疹病毒gD糖蛋白(HSV-1gD)的重组痘苗病毒，并在动物体内进行了免疫效果观察。1材料和方法1.1载体pCD/GM-CSF由北京医科大学陈慰峰教授提供，是将GM-CSF基因克隆于PCD质粒的 BamH I位点。pJSB1175D，7.5K启动子下游为HSV-1 16

5、8株gD糖蛋白基因，由病毒基因工程国家重点实验室崔虹博士提供。1.2病毒与细胞痘苗病毒天坛株VV和HSV-1 168株由病毒基因工程国家重点实验室保存。RVJ120/GM-CSF、RVJSB1175D分别为pJ120/GM-CSF、pJSB1175D质粒与VV共转染后获得的重组病毒，RVJSB1175D由病毒基因工程国家重点实验室崔虹博士提供，RVJ120/GM-CSF自备。TK-143、Vero-E6及TF-1细胞均为病毒基因工程国家重点实验室保存。原代鸡胚细胞自备。1.3动物与试剂WISTAR大鼠购于医科院动物养殖场。HSV-1gD单克隆抗体由崔虹博士提供。IgG-FITC和HRP-IgG

6、购于华美公司。1.4重组病毒的筛选与纯化按文献4。1.5聚合酶链反应(PCR)及Southern blot分析病毒DNA的提取参阅文献5。PCR反应体系为：10×Taq 缓冲液(Mg?free)5l，25mmol/LmgCl2 3l，2.5 mmocl/L mgcl2 3ul， 2-5mmol/L dNTP 3l,5，3引物各1l，模板为病毒DNA经Hind酶切后的酶解物3l，加水补到49l，煮3分钟冷却后加Taq酶1l(3U)，PCR循环参数：9445s，5545s，7245s，共循环30次，最后72延伸10分钟。核酸电泳及转膜杂交见文献6，地高辛探针标记参照Boehringer

7、Mamnhein公司使用说明书。1.6HSV-1gD表达产物的免疫荧光检测见文献7。1.7GM-CSF生物学活性的检测见文献8。1.8重组病毒表达的GM-CSF对免疫原性的影响同性别体重80g左右WISTAR大鼠随机分成3组，每组4只，分别接种VV、RVJSB1175D、RVJSB1175D/GM-CSF，每只接种3×107PFU，以腹腔、皮下、静脉(4：2：1)联合接种，初种后2周加强免疫1次，免疫途径及免疫剂量与初免相同，免疫前及免疫后每周尾静脉采血1次，按常规方法分离血清，-20保存，最后同时检测。1.9抗-HSV-1gD抗体的检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和中和试验，

8、文法参考文献9。2结果2.1重组质粒的构建用BamH I将人GM-CSF从PCD/GM-CSF切下，插入pJSB1175DRP11K启动子下游Bgl 位点，得到重组质粒pJSB1175D/GM-CSF，酶切谱分析证实GM-CSF正向正确插入。2.2重组病毒的Southern blot及PCR-Southern blot分析利用脂质体转染技术，将重组质粒pJSB1175D/GM-CSF与痘苗病毒天坛株共转染TK 143，经BudR加压选择，通过免疫荧光筛选，获得表达GM-CSF和HSV-1gD的重组病毒RVJSB1175D/GM-CSF。以该病毒DNA的Hind酶解物为模板，采用上游引物5-TA

9、GAATTCGATCCAGCCCGTCGTTCACCCAGCCC-3，下游引物5-CTGGATCCTTAATTCCTGGACTGGCTC-3扩增出一段大小约0.4kb片段，与预期相符，且转膜后进行的Southern blot分析亦证实该片段为特异性扩增产物(2)。2.3RVJSB1175D/GM-CSF重组病毒感染细胞上清中GM-CSF的活性检测RVJSB1175D/GM-CSF与RVJ120D/GM-CSF均按PFU细胞感染TK-143，收集48小时的上清，10 000r/min离心5分钟，上清经TF-1检测，表明两者均有良好维持TF-1细胞生长的能力，且两重组病毒表达的GM-CSF活性没有

10、显著性差别(表1)。表明重组病毒表达GM-CSF不受同时表达的HSV-1gD的影响，即两者可在同一病毒中共表达。表1重组病毒在TK-143细胞表达GM-CSF活性的比较Tab.1Comparison of the activity of GM-CSF expressed by recombinant vaccinia virus病毒VirusGM-CSF活性(ng/ml)GM-CSF activityRVJ120/GM-CSF101.3+/-5.1RVJSB1175D/GM-CSF97.3+/-4.5RVJ1200     表2重组病毒免疫血清抗-HSV

11、-1活性的检测(噬斑数)Tab.2Neutralization activity of sera from immunized rats against HSV-1 (No. Plague)免疫用病毒Virus for immunization抗血清稀释倍数Anti- serum dilution18132164RVJSB1175D/GM-CSF025RVJSB1175D001VV408050正常血清对照Normal serum435658    1重组质粒pJSB1175D/GM-CSF的结构Fig. 1Structure map of pJSB117

12、5D/GM-CSF    2重组病毒DNA的PCR-Southern blot分析A：电泳；B：杂交Fig. 2PCR-Southern blot of DNA of recombinant virusA: Electrophoresis; B:Southern blot1:PCD/GM-CSF. 2:RVJSB1175D/GM-CSF; 3: DNA /Hind 3免疫大鼠血清特异性抗体的ELISA检测结果Fig. 3ELISA test of antibodies in sera of immunized rats against VV and HS

13、V-1gD Serum dilution 140     2.4RVJSB1175D/GM-CSF免疫大鼠后血清抗体水平的检测RVJSB1175D/GM-CSF，RVJSB1175D及VV分别免疫大鼠，于初免后5周即加强免疫后3周，采血检测血清特异性抗体水平，经中和试验及ELISA检测，结果见表2，3。由此可见，RVJSB 1175D/GM-CSF免疫大鼠，可产生较好特异性免疫，血清1：64稀释仍有较好中和活性，与不含GM-CSF的RVJSB1175D组相比，无论ELISA滴度，还是中和活性均无显著性差别。表明无论RVJSB1175D，还是RVJSB11

14、75D/GM-CSF，在大鼠体内繁殖的同时均能表达HSV-1gD，且表达产物可刺激动物产生具有中和HSV-1能力的特异性抗体。3讨论随着细胞因子免疫调节作用的深入研究，细胞因子在免疫反应中的作用逐步得到重视，并开始利用这些细胞因子来调节机体的免疫反应，其中研究得较多的是：制备转细胞因子疫苗，以期获得高效安全的基因工程疫苗；制备转细胞因子瘤苗，用于抑制肿瘤生长、阻止肿瘤转移9；基因工程法生产的细胞因子直接用于病毒病和肿瘤的治疗。本研究中，将hGM-CSF基因及HSV-1gD分别克隆于痘苗病毒载体pJSB1175的P11K及P7.5K启动子下游，构建的表达质粒pJSB1175D/GM-CSF与痘苗

15、病毒天坛株共转染TK 143，经筛选获得可同时表达GM-CSF及HSV-1gD的重组病毒，且两者无干扰作用，从而为研究GM-CSF的佐剂作用提供可能。我们比较了RVJSB1175D/GM-CSF与RVJSB1175D免疫WISTAR大鼠，痘苗病毒抗体和HSV-1gD抗体的产生情况，结果表明两者在上述两组没有明显差别，这可能与GM-CSF主要促使非特异细胞免疫增强，而对特异性免疫调节作用不明显所致。而痘苗病毒免疫大鼠后痘苗病毒抗体水平明显高于RVJSB 1175D/GM-CSF组和RVJSB1175D组，可能是由于两重组病毒的TK区有外源基因插入，使病毒本身的毒力有所降低所致。本文受国家863高

16、科技生物技术领域基金资助作者单位：100052北京中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室1997年6月25日收稿11月20日修回参考文献1Flexner C,Moss B,William T,et al.Attenuation and immunogenicity in primates of vaccinia virus recombinants expressing hIL-2.Vaccine,1990,8:17-21.2王琴.硕士论文.北京：中国预防医学科学院病毒学研究所，1995.3Gasson J C.Molecular physiology of granulocyte-macrophage colony-stimulatihg factor.Blood,1991,77(6):1131-1145.4高峰，刘崇柏，伊瑶，等.用重组病毒载体表达甲型肝炎病毒抗原.病毒学报，1989,5:303-311.5Golini F,Kates J.Transcriptional and translational ana