紫草素抑制血管平滑肌细胞及巨噬细胞肿瘤坏死因子-α启动子活性

1、紫草素抑制血管平滑肌细胞及巨噬细胞肿瘤坏死因子-启动子活性?1378?中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiology2007,23(7):13781381文章编号10004718(2007)07137804紫草素抑制血管平滑肌细胞及巨噬细胞肿瘤坏死因子一0c启动子活性张卓琦,曹希传,朱文玲(中国医学科学院,中国协和医科大学北京协和医院心血管内科,北京100730;台湾中央研究院生物农业科学研究所筹备处,台湾台北11529)摘要目的:探讨紫草素(shikonin)对血管平滑肌细胞(VSMCs)及巨噬细胞(M'ps)体外转染的FNF基因启动子活性的调控作用.

2、方法:利用虫荧光素酶(1uciferase)报告基因系统,构建含有人类TNF基因启动子的质粒DNA,经阳离子脂质体转染体外培养的VSMCs及M'Ps,以LPS及Ang1I刺激并经不同浓度的紫草素处理后,通过检测lueiferase的活性来观察启动子活性的变化.结果:TNF启动子在VSMCs及M'ps可高效稳定地表达,分别为阳性对照(CMV启动子)的58.3%和55.6%;而经LPS及Ang1I刺激的VSMCs和M'ps中,TNF启动子活性较米受刺激时呈现明显上凋(P<0.05).在VSMCs中0.251p.mol/L,M'Ps中0.52m0l/L的

3、紫草素对未受诱导的TNF启动子表现出一定的抑制作用,更可显着抑制经LPS及Ang1I刺激后上调表达的TNF启动子活性,并且呈现剂量依赖关系(P<0.05).结论:紫草素对TNF启动子活性的抑制,证明了其对促炎细胞因子在转录水平的潜在抑制作用及对于心血管系统的潜在抗炎性质.关键词紫草素;肿瘤坏死因子;炎症反应;血管平滑肌细胞;巨噬细胞中图分类号R5文献标识码AInhibitoryeffectofshikoninontransgenictumornecrosisfactor一pro.moteractivityinvascularsmoothmusclecellsandmacropha

4、gesZHANGZhuoqi,CAOXichuan,ZHUWenling(DepartmentofCardiology,PekingUnionMedicalCollegeHospital,ChineseAcademyofMedicalScie,cenndPekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China;InstituteofBioagricultruralScience,AcademinSinicn,7ei11529.China,Email:zhuoqizhangsina.con)ABSTRACTAIM:Toevaluatetheeffectofshi

5、koninonthetransgenicTNFctpI_(】moteractivitvinculturedvascularsmoothmusclecells(VSMCs)andmaerophages(M'Ps).METHODS:HumanTNFpmmoterwasc0nstrnctedbyreportergenesystemandwastransientlytransfeetedintoVSMCsandM'psinvitro.PromoteractivitvwastestedbvlueiferaseactivitywithorwithoutLPSandAng1Istimulat

6、ion,beforeorafterdiflferentdosesofshikonintreatment.RE.SULTS:TNFpromoterwasstablyexpressedinVSMCsandM'PscomparedwilhCMVpromoter(58.3%and55.6%,respectively).BothLPSandAng1IsignificantlyupregulatedTNFpromoteractivitycomparedwithunstimulatedones(P<0.05).Shikoninsignificantlyinhibited,bothint

7、actandLPS/Ang1IstimulatedTNFpromoteractivitv,inadosedependentmanner(P<0.05),andinbothcelltypes.CONCLUSION:TheinhibitoryeffectofshikoninontheactivityofhumanTNFpromoterindicatesitspotentialsuppressiononproinflammatorycytokinegeneexpressionattranscriptionallevelanditspotentialantiinflammatorypro

8、pertyincardiovascularsystem.KEYWORDSShikonin;Tumornecrosisfactor;Inflammation:Vascularsmoothmusc1ece11s;Macmphages细胞因子介导的炎症反应参与多种心血管疾病的病理生理过程,包括动脉粥样硬化及血管介入治疗术后再狭窄等,并以内膜增殖为共同表现.在复杂的细胞因子网络中,肿瘤坏死因子一(TNF一)是调收稿日期20051020修回日期20060417现在江苏省徐州医学院附属医院心血管内科,徐州221002Tel:051686680653;Email:zhuoqizhangsina.con节炎症

9、反应的关键因子,它由多种细胞,包括巨噬细胞(M'Ps),淋巴细胞(LCs),血管平滑肌细胞(VSMCs)等合成并通过自分泌和旁分泌作用,进一步刺激VSMCs增殖,迁移及细胞外基质合成,最终导致新生内膜形成.紫草素(shikonin)是从中国传统中药材一紫草的根中提取的一种萘醌类化合物,已有研究表明紫草素及其衍生物具有明确的抑制细菌,真菌生长,促进组织愈合,抗炎,抗氧化,抑制VSMCs和肿瘤细胞系增殖,促进凋亡,抗HIV等多种生物学效应.,并涉及复杂的细胞和分子机制.本研究以体外培养的VSMCs及M'ps为系统,初步探讨紫草素对TNF一仪基因启动子活性的调控作用,为其心血管保护效

10、应提供线索和依据.材料和方法1主要试剂紫草素购自英国Fluorochem(分析纯),以二甲基亚砜(DMSO)配制成1mmol/L的贮存液,一80cc冰箱保存,使用前稀释至工作浓度.AnglI,LPS及DAPI购自Sigma,DMEM培养基,胎牛血清(FBS),青霉素一链霉素,胰蛋白酶一EDTA,PBS均购自GibcolBRL,lipofectin购自Invitrogen.2主要方法2.1细胞培养大鼠VSMCs培养采用组织块贴壁法,雄性SD大鼠,购自中央研究院(台湾)实验动物中心并经动物伦理委员会批准同意使用,体重250300g,经吸入过量CO致死后,无菌状态取出胸主动脉,14d后待原代培养的V

11、SMCs长成典型的"峰一谷"样形态后,收获并进行传代培养,实验采用46代细胞.小鼠M'Ps采用RAW264.7细胞株(ATCC,No.TIB一71),实验采用2530代细胞.所有细胞均在含10%FBS的DMEM,5%CO2,37孵箱中培养.2.2M1Tr检测紫草素作用于VSMCs及M'ps后对细胞活力的影响采用M1Tr法检测.VSMCs以l×10cells/well,Mq0s以2×10cells/well接种于96孔板,贴壁24h后,再以无血清的DMEM静止3648h,弃上清,每排8复孑L分别加入含10%FBS的DMEM,并将紫草素做倍比

12、稀释,终浓度为8,4,2,1,0.5,0.25和0Ixmol/L,作用20h后加入M1Tr试剂(5g/L,20IxL/wel1),至终点时问24h时以200IXLDMSO溶解甲瓒颗粒,在570nm下,以酶标仪读取吸光度()值.细胞活力=(A实验组一Abackund)/(A对照组一Abakd)×100%.2.3质粒构建和转染含有人类TNFOf,基因启动子的以虫荧光素酶(1uciferase)为报告基因的质粒DNA参照文献构建J,即一l049到+48bp的人类TNF一仅启动子的基因片段,经MluI及BglII酶切位点克隆到pGL3载体,命名为pTNFPLuc.无启动子的pGL3(basi

13、cvector)作为阴性对照,而含CMV?l379?即刻反应基因启动子/增强子的pCMVLuc作为阳性对照.转染效率以pEGFPC1的基因产物,即绿色荧光蛋白(GFP)的阳性表达率来评估.上述所有质粒DNA均应用阳离子脂质体lipofectin转染VSMCs及M'ps,参照使用说明操作.2.4Luciferase检测VSMCs及M'ps分别以l×10cells/well及2×10cells/well接种于6孑L板,质粒DNA2Ix#well经lipofectin转染过夜后,分别加入终浓度为lmg/LLPS,lIxmol/LAng的含10%FBS的DMEM,并

14、在30min前VSMCs组加入0.25,0.5和lIxmol/L,M'ps组加入0.5,l和2Ixmol/L的紫草素,作用24h后,以100IxL/well的细胞裂解液(1×PBS,0.1%TritonX一100,蛋白酶抑制剂)收取细胞,4离心15min,取20L上清液,以虫荧光素酶检测试剂盒(Promega)在LumatLB9507发光测定仪上检测luciferase的活性,启动子活性即以RLU(relativelightunit)表示,由仪器直接读出测定值.3统计学处理实验结果均以平均值±标准差(元±s)表示,各组间比较采用方差分析,两组问比较采取q检

15、验.结果1紫草素作用于VSMCs及M'ps的抑制曲线与对照组(0Ixmol/L组)相比,28Ixmol/L的紫草素对VSMCs细胞活力有明显的抑制作用(P<0.05);而4和8Ixmol/L的紫草素对M'Ps细胞活力有明显的抑制作用(P<0.05),见图l.本研究采用的紫草素浓度均低于药物作用于细胞的LC.浓度.,.一兰.型>=rJConcentration(gmol/L)Fig1CellviabilityofVSMCsandmacrophagesaftershikonintreatmentfor24hours.x±s.n:8

16、.'P<0.05controlgroup.图1紫草素作用于VSMCs及M'卢s24h后的细胞活力变化2质粒DNA的转染效率阳离子脂质体lipofc?tin转染pEGFPC1质粒DNA的转染效率在VSMCs及M'ps中分别为2.4%和1.5%?l380?3TNFOt启动子在VSMCs及M'ps的活性表现以CMV启动子启动的luciferase活性为阳性对照,TNF启动子在VSMCs及Mq)s的活性分别为对照组的58.3%(0.7×10'1.2×10'RLU/wel1)和55.6%(5×109×1

17、0RLU/wel1);而与未受刺激的TNF启动子活性相比,经LPS及Ang11刺激的TNF启动子活性在VSMCs及M'ps分别为1.1倍(P>0.05),1.7倍(P<0.05)和10.1倍(P<0.05),3.0倍(P<0.05),见图2.1.0E+061.0E+051.0E+041.0E+O3VSMCSM中SFig2TNFdpromoteractivityinVSMCsandmacrophages.4-s.n=6.P<0.05铘unstimulatedpTNFPLucgroup?图2TNF启动子在VSMCs及M&

18、#39;ps中的活性表现4紫草素抑制TNF一仅启动子在VSMCs中表达0.25,0.5和1Izmol/L的紫草素呈浓度依赖性地抑制VSMCs中TNF启动子活性,与未加药组相比,抑制率分别为:未受刺激组12.0%,31.0%和57.0%;LPS刺激组9.1%,50.O%和61.8%;AngII刺激组11.2%,55.9%和70.6%.尤以0.5和1mol/L作用显着(P<0.05),见图3.WithoutLPSAngIIstimulationstimulationstimulationFig3InhibitioneffectofshikoninonTNFotpromoteracti

19、vityinVSMCs.4-S.n=6,P<0.05shikoninuntreatmentgroup.图3紫草素对TNF启动子在VSMCs中表达的抑制作用5紫草素抑制TNF一仅启动子在M'ps中表达0.5,1和2moVL的紫草素呈浓度依赖性地抑制Mq)s中TNF启动子活性,与未加药组相比,抑制率分别为:未受刺激组10.0%,17.0%和28.0%;LPS刺激组19.0%,47.4%和58.5%;Ang刺激组20.0%,45.3%和50.3%.尤以1和2moVL作用显着(P<0.05),见图4.讨论炎症反应导致的内膜增生是多种血管增殖性疾病的共同表现,动脉损伤

20、后,诸多促炎细胞因子基因被不同程度地激活,其中以TNFOt被公认为此过程中的关键因子,它在血管损伤部位上调表达,发挥多种病理生理效应,如提高内皮细胞通透性,刺激急性期蛋白分泌,诱导基质金属蛋白酶,黏附分子及其它细胞因子和生长因子表达等',最终导致新生内膜形成.因此,多种旨在针对TNF的治疗措施(如抗TNF抗体洗脱支架lo1)均起到一定的抑制VSMCs增殖及新生内膜形成的作用.人类TNF基因位于6p23一q12,其启动子区域含有多个转录因子结合位点,包括NFKB,NFAT,AP1,CREB,STAT1及LITAF等,因此,TNF基因可被多种刺激信号(物理,化学损伤,促炎物质等)所启动.本

21、实验构建了含有人类TNFOr.基因启动子全长的质粒DNA,并经第一代阳离子脂质体lipofectin转染体外培养的VSMCs及Mq)s,由于luciferase检测系统灵敏度高且表达稳定,弥补了转染效率相对较低的不足,因此可以作为研究各种信号调控TNF基因转录的良好平台.研究发现,体外转染的TNF启动子在VSMCs及Mq)s中均可高效稳定地表达,分别为阳性对照(CMV启动子)的¨m98765432f1rIu!Ia如;2如O2llllOOOf1厂ru三苗Ia58.3%和55.6%:而经LPS及AngI1刺激的VSMCs和M'ps中,TNF一启动子活性呈现明显上调(P&l

22、t;0.05),直接证明了两者参与炎症反应的可能机制以及对TNF一基因转录的调节,与Sato等报道的在心肌成纤维细胞中的结果相一致.紫草素与心血管系统炎症反应的关系文献少有报道,本研究发现紫草素对VSMCs及M'ps体外转染的TNF一启动子活性有明确的抑制作用,不仅对未受诱导的启动子表现出一定的抑制效果,更可显着抑制经LPS及AngI1刺激后上调表达的TNF一启动子活性,并且呈现剂量依赖关系(P<0.05).可见紫草素未像其它促炎信号一样激活促炎细胞因子基因表达,即不具有促炎性质.又可抑制受刺激而上调表达的促炎细胞因子基因转录,证明了其可能的抗炎特性.当然,紫草素经何种细

23、胞信号转导途径发挥其抑制TNF一仅启动子的转录活性,这种抑制作用是针对TNF一特异性的,还是对其它促炎细胞因子基因转录具有普遍性的,尚不十分明确;它对TNF一基因产物的生成(即活性TNF一蛋白)是否具有明确的抑制作用,仍需深入研究.234参考文献RossR.AtherosclerosisaninflammatorydiseaseJ.NEnglJMed,1999,340(2):l15126.DonnersMM,DaemenMJ,CleutjensKB,eta1.Inflammationandrestenosis:implicationsfortherapyJ.AnnMed,2o03,35(7):

24、523531.ClausellN,deLimaVC,MolossiS,eta1.ExpressionoftumournecrosisfactoralphaandaccumulationoffibronectinincoronaryarteryrestenoticlesionsretrievedbyatherectomyJ.BrHeartJ,1995,73(6):534539.ChenX,OppenheimJ,Howard0M,eta1.Shikonin,acomponentofantiinflammatoryChineseherbalmedicine,selectivelyblockschem

25、okinebindingtoCCchemo一567891O12?l38l?kinereceptorlJ.IntImmunopharmacol,2001,1(2):229236.StaniforthV,WangSY,ShyurLF,eta1.Shikonins,phytocompoundsfromLithospermumerythrorhizon,inhibitthetranscriptionalactivationofhumantumornecrosisfactorOtpromoterinvivoJ.JBiolChem,2004,279(7):58775885.WuZ,WuL,LiL,eta1.p53一mediatedcellcyclearrestandapoptosisinducedbyshikoninviaacaspase9dependentmechanisminhumanmalignantmelanomaA375一s2cellsJ.JPharmacolSci,2004,94(2):166一l76.张卓琦,曹希传,张玲,等.紫草素对大鼠血管平滑肌细胞增殖