硝酸毛果芸香碱滴眼液的高效液相色谱分析及其稳定性考察

1、    硝酸毛果芸香碱滴眼液的高效液相色谱分析及其稳定性考察        摘要目的:建立以高效液相色谱法测定硝酸毛果芸香碱滴眼液中硝酸毛果芸香碱的含量及其降解产物，同时进行了其稳定性考察。方法:以Shim-pack Clc-phenye为固定相，乙腈-5%磷酸二氢钾水溶液(6100)用磷酸调节pH至3.0为流动相，邻苯二甲酸为内标物，检测波长为230 nm，以加速实验法考察光和pH值等影响因素。结果:回收率±RSD为100.2%±0.6%(n=5)，且滴

2、眼液以pH=4.5左右最为稳定。结论:方法简单，快速，专属性强关键词高效液相色谱法，硝酸毛果芸香碱，滴眼液，稳定性 HPLC determination of pilocarpine nitrate in eyedrops and studies on its stabilityXiao Yang，Shang Suqing(Shenzhen Daphne Pharmaceuticals Co. LTD,Shenzhen 518049)ABSTRACTOBJECTIVE:To determine pilocarpine nitrate and its degradation products b

3、y HPLC,study the stability of pilocarpine nitrate eye-drops.METHODS:Using o-phthalic acid as internal standerd,detection was at 230 nm,column was Shim-pack Clc-Phenye,mobile phase was acetonitrile- 5% KH2PO4(6100) using H3PO4 adjust pH to 3.0. The influence of light,pH on the stability of pilocarpin

4、e nitrate eye-drops was studied.RESULTS:Average recovery was 100.5%±0.6%(±RSD,n=5), The optimum pH was 4.5.CONCLUSIONS:The method is simple and specific.KEY WORDSHPLC,pilocarpine nitrate,eyedrops,stabilities硝酸毛果芸香碱(Pilocarpine Nitrate)滴眼液是临床上常用的青光眼治疗剂和缩瞳药。据文献报道14，滴眼液中硝酸毛果芸香碱不稳定，易异构化和降解，致使药

5、物的药理活性降低，其降解的程度与制备工艺和贮存条件等因素有关。中国药典1995年版5中，硝酸毛果芸香碱滴眼液的含量测定为高效液相色谱法，但在其色谱条件下，毛果芸香碱峰的容量因子(K)太小，各降解产物峰之间和降解产物与毛果芸香碱峰之间不能有效地分离。本文建立了另一种色谱系统，通过测定经光和pH值等影响因素的加速实验后的滴眼液含量，考察硝酸毛果芸香碱滴眼液的稳定性。1仪器与试药Waters高效液相色谱仪系列：490紫外检测器，740数据处理机，510输液泵，7125定量进样 阀；硝酸毛果芸香碱对照品(由中国药品生物制品检定所提供)；硝酸毛果芸香碱原料(950105， 进口分装，符合英国药典1988

6、年版规定，上海川沙金联制药公司出品)；1%硝酸毛果芸香碱滴眼液(市售，批号940730，950823，960412，960527)；尼泊金乙酯0.03 g、硝酸毛果芸香碱1.0 g与氯化钠0.68 g，制成无菌滴眼液(由我单位自制，批号960903，960904，960905)；内标物：邻苯二甲酸(分析纯)；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯。2实验与结果2.1色谱条件流动相：乙腈-5%磷酸二氢钾水溶液(6100)用磷酸调节pH至3.0；色谱柱：Shim-pack Clc-Phenye0.15 m×6.0 mm；测定波长：230 nm；流速：1.0 ml.min-

7、1；柱温：室温；进样量：20 l。2.2干扰物质的考察取硝酸毛果芸香碱适量，用0.01 mol.L -1氢氧化钠液溶解成浓度为1%的样品，置水浴中回流2 h，照样品溶液测定项下的方法(2.5小节)稀释配制。进样得HPLC色谱2，与滴眼液的色谱1相比，可看出：硝酸，降解产物a、b、c，毛果芸香碱和内标物邻苯二甲酸的保留时间分别为3.8，7.9，8.6，11.2，12.6 min和15.6 min，各峰之间有良好的分离度，说明该HPLC法专属性较强，可用于稳定性研究。1硝酸毛果芸香碱滴眼液色谱1.溶剂 2.硝酸 3.毛果芸香碱 4.邻苯二甲酸2硝酸毛果芸香碱滴眼液及其降解产物色谱1.溶剂 2.硝酸

8、 3.a 4.b 5.c 6.毛果芸香碱 7.邻苯二甲酸2.3线性关系取经105 干燥2 h的硝酸毛果芸香碱对照品约100 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。分别精密吸取该溶液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 ml至25 ml容量瓶中，分别精密加内标溶液(取邻苯二甲酸 20 mg，置50 ml容瓶中，加水适量，超声溶解并加水至刻度，摇匀即得)2.0 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀。按上述实验条件进行HPLC测定，计算峰面积之比，以毛果芸香碱与邻苯二甲酸峰面积之比为纵坐标(Y)，以相应的硝酸毛果芸香碱浓度为横坐标(X)进行线性回归，线性回归方程为：Y=0.007+

9、16.5X，r=0.999 9，n=5。从上看出，在0.02240.224 mg.ml-1浓度范围内峰面积之比与硝酸毛果芸香碱浓度之间存在着良好的线性关系。2.4制剂回收率精密称取硝酸毛果芸香碱对照品及辅料适量，按处方4配制样品。精密吸取各滴眼液2.0 ml至25 ml容量瓶中，分别精密加入内标溶液2.0 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀。按上述实验条件进行HPLC测定，计算制剂平均回收率±RSD为100.2%±0.6%(n=5)，说明该HPLC法有较高的回收率和较小的相对标准偏差。2.5制剂的含量测定取4个批号的样品，分别按回收率试验(2.4 小节)操作项下稀释样品和测定，

10、结果见表1。表 1硝酸毛果芸香碱滴眼液含量测定结果(n=3)*1 批号含量/%*2RSD/%降解产物/%*396052795.60.420.496041296.40.230.995082392.10.456.994073082.50.5514.6注：*1 测定时间1996年9月；*2 用内标法测得的毛果芸香碱含量；*3 因无降解产物对照品，用归一化法计算的降解产物的含量。 2.6光照实验取自制样品的安瓿，置光照度为3 000 Lx处(距40W 日光灯约20 cm处，室温平均温度25)，于1，3，6，10 d取出，采用上述HPLC法测定降解产物和毛果芸香碱的含量，并与0 d比较，结果为：按归一化

11、法计算的所有降解产物的总量0.5%，故认为本滴眼液对光不敏感。2.7pH值影响实验按处方配制10%的硝酸毛果芸香碱滴眼液，精密量取适量，用不同pH值(3，4，5，6，7，8)的磷酸盐缓冲液稀释至1%浓度的滴眼液，置室温(25 )放置1周后，按上述HPLC法测定。因无降解产物对照品，其含量均采用归一化法，以所有降解产物的总和计算。毛果芸香碱的含量以各pH液中毛果芸香碱的含量相对于10%浓度的滴眼液用流动相稀释后测得的毛果芸香碱的含量计算，即相对百分含量。结果以pH为4.5时最为稳定。3讨论3.1毛果芸香碱分子结构中含有亚胺唑核及内酯结构，其水溶液受H+ 、OH-催化水解，其中包括有开环生成毛果芸

12、香酸或异构化成异毛果芸香酸、异毛果芸香碱。实验证明，本滴眼液在pH=4.5左右最为稳定，且不稳定时以降解产物a含量最高，b次之，c最少。参照文献1.2推测中降解产物a、b、c分别为毛果芸香酸、异毛果芸香酸和异毛果芸香碱。3.2硝酸毛果芸香碱滴眼液受温度影响大，有文献报道4，本滴眼液经100加热30 min后，含量降至97%，随后贮存在25，有效期只有3周。3.3硝酸毛果芸香碱有很好的溶解度，作者认为要解决其滴眼液不稳定，不利于大生产等问题，可在剂型上稍作改进，即将硝酸毛果芸香碱和氯化钠等原辅料制成易溶的片，临用时用一定量的灭菌水溶液，振摇溶解而成，类似于市售的白内停滴眼液和利福平滴眼液。作者单位：肖仰(深圳大佛药业有限公司深圳518049)尚素琴(武汉市药品检验所)参考文献1Ping-hong Chung,Ting-fong Chin,and John L.Lach.Kinetics of the hydrolysis of pilocarpine in aqueous solution. J Pharm Sci,1970,59(9):13002Mathews A.Nunes and Einar Brochma